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LncRNA的一般研究策略

1 LncRNA的一般研究策略

LncRNA的一般研究策略.png

1 LncRNA的一般研究策略

 

1LncRNA篩選

通過lncRNA芯片或RNA測(cè)序等方法對(duì)多對(duì)疾病模型和對(duì)照樣本組織進(jìn)行lncRNA表達(dá)譜分析;通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncRNA,構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),預(yù)測(cè)lncRNA的靶基因;通過PCRNorthern Blot技術(shù)對(duì)候選lncRNA驗(yàn)證,確定其表達(dá)差異。

2LncRNA全長(zhǎng)克隆

可以通過5'RACE獲取lncRNA 5'全長(zhǎng),3'RACE獲取lncRNA 3'全長(zhǎng),最終拿到完整的lncRNA序列。

3)表達(dá)分析

細(xì)胞水平表達(dá):在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)表達(dá)差異。

組織分布:檢測(cè)不同組織、不同階段表達(dá)特性。

表達(dá)水平動(dòng)力學(xué)變化:比較不同處理?xiàng)l件下,如藥物處理、誘導(dǎo)處理下,表達(dá)水平差異。

4)功能研究

功能獲得性研究:構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體。

功能缺失性研究:可通過siRNA、shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA,干預(yù)       lncRNA后檢測(cè)其對(duì)疾病相關(guān)基因表達(dá)影響和對(duì)細(xì)胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響。

可通過RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法檢測(cè)與lncRNA結(jié)合的DNA、RNA、蛋白質(zhì)。

表達(dá)調(diào)控:將lncRNA表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合,解釋lncRNA調(diào)控機(jī)理。

轉(zhuǎn)錄因子:研究lncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。

染色質(zhì)重塑:lncRNA表觀調(diào)控。

ceRNA機(jī)制:研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之間的調(diào)控機(jī)制。

 

2 LncRNA的一般研究實(shí)驗(yàn)手段

 

 LncRNA的一般研究實(shí)驗(yàn)手段.png

2 LncRNA的一般研究實(shí)驗(yàn)手段

 

1)與蛋白質(zhì)的相互作用

識(shí)別lncRNA的蛋白質(zhì)伙伴,可以為它們的功能的機(jī)制和路徑提高線索。RIP技術(shù),如chemical-cross-linked RIP、native RIP (nRIP)UV-crosslinked immunoprecipitation (CLIP)使用抗體來pulldown核蛋白復(fù)合物,然后從中分離相關(guān)RNA用于分析。每個(gè)變體都有它各自的優(yōu)勢(shì)和缺陷。nRIP提供交聯(lián)產(chǎn)物,而CLIP在避免交聯(lián)產(chǎn)物的重新組合的同時(shí)用于識(shí)別RNA與蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)。這些技術(shù)可以結(jié)合高通量測(cè)序,如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq,來識(shí)別lncRNA相互作用的全部宿主蛋白質(zhì)因子,盡管還需要技術(shù)手段的確認(rèn)。

2)與DNA的相互作用

有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)被用于識(shí)別lncRNA的基因組靶位點(diǎn)。以染色體免疫共沉淀(ChIP)和RIP技術(shù)的原理為基礎(chǔ),使用染色體RNA免疫共沉淀ChRIP)來識(shí)別與特殊染色體標(biāo)簽相互作用的RNA。另一方面,chromatin oligo-affinity precipitation (ChOP)、chromatin isolation by RNA purification (ChIRP)capture hybridization of RNA targets (CHART)使用標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸來識(shí)別與目的RNA相互作用的DNA位點(diǎn)。

 

ChIRP基本實(shí)驗(yàn)流程.png


3 ChIRP基本實(shí)驗(yàn)流程

 

3)結(jié)構(gòu)特征

lncRNA可以形成特殊的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)來執(zhí)行它們的功能。通過selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE)in-line probing來獲得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析,如SHAPE-Seq,連接其它依賴于RNA酶消化的技術(shù),如fragmentation sequencing (FragSeq)parallel analysis of RNA structure (PARS)


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