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AGO2在miRNA研究中的應(yīng)用

AGO蛋白在miRNA通路中發(fā)揮多種功能。它們通過產(chǎn)生ac-pre-miRNA，參與了miRNA裝配的過程，同時它們是RISC效應(yīng)器蛋白，介導(dǎo)mRNA降解、去穩(wěn)定作用或者轉(zhuǎn)錄抑制。另外，AGO2蛋白可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控調(diào)節(jié)miRNA豐度，內(nèi)源性Ago2的減少會降低成熟miRNA的表達和活性。Ago2的這個特殊功能是獨立于它的剪切功能及內(nèi)切酶活性的。

 

1 人類AGO2蛋白

3.2 F1 人源AGO2基因染色體及cDNA結(jié)構(gòu)圖.png

人源AGO2基因染色體及cDNA結(jié)構(gòu)圖.png

圖1 人源AGO2基因染色體及cDNA結(jié)構(gòu)圖

 

盡管所有的Argonaute蛋白都具有Piwi結(jié)構(gòu)域，但并非所有的Argonaute蛋白都具有剪切活性。研究表明，人體內(nèi)4中AGO蛋白（EIF2C1/hAGO1，EIF2C2/hAGO2，EIF2C3/hAGO3，EIF2C4/hAGO4）中，只有EIF2C2/hAGO2具有剪切活性。進一步研究顯示，RNase H酶的活性位點包括一個天冬氨酸-天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸肽鏈（Asp-Asp-Glu/Asp motif），正是這段肽鏈與Mg2+結(jié)合。人體AGO1及AGO4蛋白中的肽鏈都和這段保守的天冬氨酸-天冬氨酸-組氨酸肽鏈不同，而AGO3雖然擁有相同的保守肽鏈，在體外實驗中同樣未表現(xiàn)出剪切活性。體外實驗中，通過突變改變?nèi)梭wAGO2這段保守序列后，AGO2失去剪切活性。

 

表1 基因沉默中可能與AGO2相互作用的蛋白

基因沉默中可能與AGO2相互作用的蛋白.png


為得到AGO2蛋白具有剪切功能的直接證據(jù)，Meister構(gòu)建了EGFP標記的報告基因。將此報告基因轉(zhuǎn)染Hela細胞，篩選得到穩(wěn)定表達的細胞株。向此細胞株中轉(zhuǎn)染與報告基因的3’-UTR互不配對的全長miR16。一段時間培養(yǎng)后，實驗組（轉(zhuǎn)染miR16）Hela細胞表達的綠色熒光明顯減弱，對照組（未轉(zhuǎn)染miR16）熒光無明顯變化，證實EGFP標記的此報告基因可被miR16抑制表達。選取實驗組細胞，分別敲除AGO1-4。與未敲除細胞相比，敲除AGO1/ AGO3/ AGO4組細胞熒光表達無明顯變化；敲除AGO2組細胞熒光表達明顯上調(diào)。證實在miRNA介導(dǎo)的對靶mRNA的降解過程中，只有AGO2具有剪切活性，能夠剪切mRNA。

 

2 AGO2影響miRNA作用的發(fā)揮

（1）AGO2參與miRNA裝配過程

在細胞核中，RNA合成酶II或III產(chǎn)生Pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本，接著Drosha-DGCR8復(fù)合物對pri-miRNA進行剪切，獲得的前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)，pre-miRNA，被Exportin-5-Ran-GTP從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)。RNA酶Dicer與雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRBP的復(fù)合物剪切pre-miRNA 為它的成熟長度。成熟miRNA的功能鏈被Ago2裝配到RNA介導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC上，它引導(dǎo)RISC，通過mRNA剪切、轉(zhuǎn)錄抑制或脫腺苷化對靶mRNA進行沉默，而信使鏈則被分解。

 

miRNA生產(chǎn)過程的“線性化”經(jīng)典途徑.png

圖2 miRNA生產(chǎn)過程的“線性化”經(jīng)典途徑

 

（2）AGO2的修飾調(diào)節(jié)AGO2的活性機制

在細胞應(yīng)激條件下，人AGO2蛋白可以在Ser387殘基被p38 MAP激酶磷酸化有助于AGO2定位到處理器processing bodies上。P-bodies是非轉(zhuǎn)錄mRNA和與mRNA翻轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的多種酶系的累積場所，包括AGO2蛋白和miRNAs。

miRNA生產(chǎn)過程因子的調(diào)控.png

圖3 miRNA生產(chǎn)過程因子的調(diào)控

 

（3）RISC裝配復(fù)合物（RLC）：Dicer、TRBP和PACT與AGO2的連接

RISC是miRNA通路的細胞質(zhì)效應(yīng)器，包括一個單鏈miRNA將它引導(dǎo)至其靶mRNA。細胞質(zhì)miRNA的處理和RISC的裝配都是被RLC所介導(dǎo)。RLC是一個多蛋白復(fù)合物，包括RNase Dicer、雙鏈RNA結(jié)合蛋白復(fù)合物TRBP（Tar RNA binding protein）和PKR的蛋白激活物PACT，其核心組分為AGO2，介導(dǎo)RISC作用于mRNA靶位點。

Dicer和TRBP相互作用，而后被Ago2招募，形成三體復(fù)合物，結(jié)合被轉(zhuǎn)運的pre-miRNA組成RISC裝配復(fù)合物RLC。

Dicer、TRBP與AGO2的連接.png

圖4 Dicer、TRBP與AGO2的連接

 

（4）AGO2介導(dǎo)pre-miRNA的剪切：ac-pre-miRNA

由于miRNA的發(fā)夾莖環(huán)結(jié)構(gòu)上序列互補程度非常高，在Dicer介導(dǎo)的序列剪切之前需要一個額外的內(nèi)切核苷酸的剪切步驟：AGO2的剪切功能被激活，剪切發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’ 臂——預(yù)期為信使鏈的中間，得到一個帶缺口的發(fā)夾架構(gòu)，產(chǎn)生AGO2-剪切的miRNA前體或稱為ac-pre-miRNA。Dicer處理這個前體和pre-miRNA的效率是一樣的。

AGO2介導(dǎo)pre-miRNA的剪切.png

圖5 AGO2介導(dǎo)pre-miRNA的剪切

 

3 AGO2的實驗應(yīng)用

AGO2是RISC的核心組分，聯(lián)系著miRNA和它們的mRNA靶位點。因此，在合適的條件下對AGO2的免疫純化（IP）可以獲得相互結(jié)合的miRNA和mRNA，從而識別miRNA的靶位點。還可以進行免疫熒光，檢測三者復(fù)合物在細胞內(nèi)的定位。

 

結(jié)合AGO2的RNA的系統(tǒng)分選與鑒定.png


圖6 結(jié)合AGO2的RNA的系統(tǒng)分選與鑒定

 



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