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miRNA的一般研究策略

miRNA也稱微RNAmicroRNA,是真核生物中廣泛存在的一種長(zhǎng)度為21-23ntRNA分子,可通過與mRNA的結(jié)合,抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄,因此在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時(shí)序等方面起重要作用。

miRNA的一般研究策略及相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段.png

1 miRNA的一般研究策略及相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段

 

1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因

要對(duì)miRNA進(jìn)行研究,首先需要采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)miRNA的靶基因位點(diǎn),即被miRNA基因沉默的作用部位。如TargetScan algorithm、PicTar algorithmDIANA-microT algorithm、miRanda algorithm、PITArna22 algorithms。

 

2 靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果確認(rèn)

進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)之后,接著是要通過miRNA pulldown方法,識(shí)別靶基因位點(diǎn)。其中,有以下三種常用的pull-down方法:

(1)生物素化的miRNA pull-downbiotinylated miRNA pull-down)。通過生物素標(biāo)記的合成miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,孵育后裂解細(xì)胞,用鏈霉親和素包被磁珠吸附篩選miRNA及其作用的mRNA。

生物素化的miRNA pull-down.png

圖2 生物素化的miRNA pull-down

(2)標(biāo)記的miRNA pull-downlabeled microRNA pull-down assayLAMP),通過用地高辛(DIG)標(biāo)記的pre-miRNA寡核苷酸與細(xì)胞提取物混合孵育,用抗地高辛的抗體做免疫共沉淀(IP),獲得被共沉淀的mRNA。

(3)核蛋白免疫共沉淀-RNA高通量測(cè)序Ribonucleoprotein immunoprecipitation followed by microarray chip analysis,RIP-ChipRIP-seq),通過用合成的miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,孵育后裂解細(xì)胞,用特異的抗AGO2抗體對(duì)RISC進(jìn)行免疫共沉淀,對(duì)獲得的mRNA進(jìn)行microarray分析。

 

RIP-Chip基本實(shí)驗(yàn)流程.png


3 RIP-Chip基本實(shí)驗(yàn)流程

  

3 miRNA的直接功能確認(rèn)

通過實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證miRNA是否能特異結(jié)合靶mRNA并特異抑制其表達(dá)。

(1)3’-UTR reporter assay

通過在報(bào)告基因如熒光素酶CDS的下游3’-UTR區(qū)域插入待確認(rèn)的目的基因,克隆到載體如psiCHECK-2上,載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,再用miRNA進(jìn)行處理,如果目的基因上含有靶位點(diǎn),則熒光素酶的轉(zhuǎn)錄受到抑制不發(fā)熒光。

 

3’-UTR報(bào)告基因基本實(shí)驗(yàn)流程.png


4  3’-UTR報(bào)告基因基本實(shí)驗(yàn)流程


3’-UTR報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA直接作用情況.png

5  3’-UTR報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA直接作用情況


(2)miRNA的上調(diào)與下調(diào)

通過人工合成miRNA模擬物(miRNA mimics)或miRNA抑制物(miRNA inhibitor),增強(qiáng)或抑制miRNA的抑制效果,并與對(duì)照相比。

 miRNA的上調(diào)與下調(diào)驗(yàn)證miRNA直接作用情況.png


6 miRNA的上調(diào)與下調(diào)驗(yàn)證miRNA直接作用情況

 

(3)位點(diǎn)定向突變(site-directed mutagenesis

首先,將待測(cè)基因反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過用致突變的引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增;然后,用相關(guān)的酶(一般為Kinase-Ligase-DpnI)對(duì)cDNA模板進(jìn)行消化,克隆到報(bào)告基因載體;最后,將構(gòu)建好的克隆轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。若表達(dá)顯著下降,可表明靶位點(diǎn)定位準(zhǔn)確。

位點(diǎn)定向突變基本實(shí)驗(yàn)流程.png

位點(diǎn)定向突變基本實(shí)驗(yàn)流程

 

4 miRNA的整體功能驗(yàn)證

對(duì)miRNA的上調(diào)/下調(diào),通過Western Blot或其他生物學(xué)通路分析實(shí)驗(yàn),探究miRNA最終是如何影響細(xì)胞、疾病等等情況。

 

5 miRNA的定量和定位

通過RT-qPCR、原位雜交(in situ hybridization)、microarray等實(shí)驗(yàn)手段,確定miRNA的具體表達(dá)量及其所在位置,以明確補(bǔ)充其機(jī)理研究。



 


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