技術(shù)服務(wù)描述

circRNA測序與分析報告

1. CircRNA背景及分析流程簡介

1.1. 背景簡介

??環(huán)形RNA是一類在真核生物中廣泛存在的具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。已有文獻(xiàn)表明，在生物體內(nèi)，環(huán)形RNA有著miRNA海綿、RBP海綿以及翻譯短肽等多項功能，在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。 目前研究表明，大部分環(huán)形RNA來源于蛋白編碼基因的外顯子區(qū)域。在pre-mRNA剪接的過程中，除典型的內(nèi)含子剪接事件外，還可能會發(fā)生5’端到3’端的反向剪接事件，從而形成環(huán)形RNA。因此，剪接產(chǎn)物中環(huán)形RNA所占比例是環(huán)形RNA分析的重要指標(biāo)之一，具有高成環(huán)比例的環(huán)形RNA分子，可能具有更加重要的生物學(xué)功能。 同時，同一基因內(nèi)部也可能產(chǎn)生多種不同的環(huán)形RNA，基因內(nèi)對環(huán)形RNA產(chǎn)生位點的使用偏好，也在一定程度上反映了轉(zhuǎn)錄過程對環(huán)形RNA產(chǎn)生的調(diào)控。因此，環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本水平的準(zhǔn)確定量，是目前環(huán)形RNA分析的重要基礎(chǔ)。
??為了解決該問題，趙方慶團(tuán)隊開發(fā)了一個新的環(huán)形RNA分析算法。根據(jù)已有工具鑒定出的環(huán)形RNA成環(huán)位點信息，研究人員重構(gòu)了具有反向剪接特征的環(huán)形RNA參考序列，簡化了復(fù)雜的反向剪接位點比對問題，并結(jié)合測序讀段比對到參考基因組和環(huán)形序列的結(jié)果，篩選出了高置信度的來自環(huán)形RNA的讀段，解決了目前環(huán)形RNA識別和定量方法中準(zhǔn)確度低和假陽性率高的問題。作者在模擬數(shù)據(jù)和真實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，對多種常用環(huán)形RNA識別軟件的表現(xiàn)進(jìn)行了綜合評估，發(fā)現(xiàn)該研究中開發(fā)的方法在環(huán)形RNA表達(dá)量和成環(huán)比例的計算中，均取得了最佳的結(jié)果。

1.2. 分析流程

??將下機測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除接頭及各類低質(zhì)量序列。隨后借助于CIRIquant，使用Hisat2與參考基因組比對，Stringtie進(jìn)行基因水平定量；同時使用bwa-men與參考基因組比對，進(jìn)行circRNA的鑒定，構(gòu)建circRNA參考序列；將構(gòu)建的circRNA序列作為參考基因組使用Hisat2再次進(jìn)行比對，篩選出高置信度的來自環(huán)形RNA的reads；統(tǒng)計circRNA的表達(dá)情況，并注釋circRNA信息。通過對circRNA差異分析，篩選出具有顯著差異的circRNA所對相應(yīng)的基因進(jìn)行后續(xù)富集分析。 circRNA信息分析簡易流程如下所示。

2. 分析結(jié)果

2.1. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

??對原始測序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估。測序數(shù)據(jù)一般為雙端測序，因此，每個測序樣本會有兩個測序結(jié)果。

評估的具體內(nèi)容：

2.2. CIRIquant分析

2.2.1. CIRIquant分析結(jié)果文件

1 . 比對結(jié)果文件：

以上結(jié)果位于文件夾：result/02.CIRIquant/1.mapping/

2 . CIRIquant鑒定結(jié)果文件：

以上結(jié)果位于文件夾：result/02.CIRIquant/2.circRNA_detection/

3 . CIRIquant鑒定結(jié)果的統(tǒng)計結(jié)果文件：

以上結(jié)果位于文件夾：result/03.circRNA_info

以上統(tǒng)計圖的可視化文件：result/03.circRNA_info/view.html

表頭說明： （result/03.circRNA_info/1.circRNA_annotation/*csv 鑒定的circRNA的注釋信息表）

2.2.2. 參考基因組比對

??測序片段（fragments）是隨機打斷的，為了確定這些一段由哪些基因轉(zhuǎn)錄來，需要將質(zhì)控后的clean reads比對到參考基因組上。使用HISAT2軟件將Clean Reads與參考基因組進(jìn)行快速精確的比對，獲取Reads在參考基因組上的定位信息^[4]。HISAT2軟件官方手冊。

??如果參考基因組組裝的較為完善，而且所測物種與參考基因組一致，且相關(guān)實驗不存在污染，那么實驗所產(chǎn)生的測序reads成功比對到基因組的比例會高于70% (Total Mapped Reads or Fragments)。本項目所用參考基因組為 hg38。

2.2.3. circRNA 預(yù)測及鑒定

?? 使用CIRIquant鑒定 circRNA ，并預(yù)測 circRNA 的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)的circRNAs主要來源于基因外顯子exon，但還有其他類型，比如來源于內(nèi)含子intron、基因間intergenic、反義鏈antisense。為了更進(jìn)一步了解鑒定得到的circRNA詳細(xì)信息，隨后進(jìn)行circRNA類型，circRNA 的長度分布，circRNA 的染色體分布分別進(jìn)行分析，統(tǒng)計分析圖如下。

result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/Demo-input.png	result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/Demo-target.png
result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/Demo-input.png	result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/Demo-target.png
result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-input_barplot.png	result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-target_barplot.png
result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-input_pie.png	result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/Demo-target_pie.png

2.3. circRNA 差異分析

??對于無重復(fù)樣本，使用CIRIquant的CIRI_DE工具鑒定差異表達(dá)的circRNA。輸出的 DE_score 綜合了倍數(shù)變化和p值，從而提供了一種有效的方法來對差異表達(dá)的circRNA排名。此處我們篩選 |DE_score| > 1 作為顯著差異表達(dá)結(jié)果。

2.3.1. 差異分析結(jié)果文件

以上結(jié)果位于文件夾：result/04.DE/

表頭說明： （result/04.DE/targetVSinput_deg*.xls差異分析結(jié)果文件）

2.3.2. 差異circRNA的基因組可視化

??可將比對結(jié)果bw文件、CIRIquant鑒定得到的circRNA的bed文件、以及差異circRNA分析結(jié)果同時放入IGV查看，如：

2.4. 差異circRNA宿主基因富集分析

??我們將差異circRNA的宿主基因，挑選出僅為 protein coding 的基因，用這些基因進(jìn)行后續(xù)富集分析。

??我們根據(jù)基因表達(dá)量分析得到差異基因之后，必須進(jìn)一步落到基因的功能上來。對于差異分析而言，往往涉及到成千上萬個基因，這會使分析變得很復(fù)雜。解決思路是將一個基因列表分成多個部分，從而減少分析的復(fù)雜度。為了解決怎么分成不同類，通常會對基因功能進(jìn)行富集分析, 期望發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用的生物通路, 從而揭示和理解生物學(xué)過程的基本分子機制。功能富集分析可以將成百上千個基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以減少分析的復(fù)雜度。另外，在兩種不同實驗條件下，激活的通路顯然比簡單的基因或蛋白列表更有說服力?；蚬δ芨患治鍪紫纫獦?gòu)建基因集（ gene set，如 GO 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫等），也就是基因組注釋信息進(jìn)行分類。然后再把我們的目標(biāo)基因集（差異基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意區(qū)分注釋與富集。

??我們采用 clusterProfiler 軟件對差異基因集進(jìn)行 GO 功能富集分析， KEGG 通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得差異基因并注釋到 GO 或 KEGG 數(shù)據(jù)庫的基因集，背景基因集為所有進(jìn)行差異顯著分析的基因并注釋到 GO 或 KEGG 數(shù)據(jù)庫的基因集。富集分析結(jié)果是對每個差異比較組合的所有差異基因集、上調(diào)差異基因集、下調(diào)差異基因集進(jìn)行富集。本報告中展示的表格是選取某一個比較組合的富集分析結(jié)果，圖片是部分富集分析結(jié)果。

圖 5 基因富集分析原理圖

2.4.1. 富集分析結(jié)果文件

以上結(jié)果位于文件夾：result/05.Enrichment/

網(wǎng)頁預(yù)覽圖：

• result/05.Enrichment/ALL-pdf.html

• result/05.Enrichment/DOWN-pdf.html

• result/05.Enrichment/UP-pdf.html

表頭說明： （result/05.Enrichment/*/gene.ego_*.csv GO富集結(jié)果列表）

表頭說明： （result/05.Enrichment/*/gene.KEGG*.csv KEGG富集結(jié)果列表）

2.4.2. GO功能富集分析

?? GO(Gene Ontology) 是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，可分為生物過程（ biological process ）和細(xì)胞組成（ cellular component ）分子功能（ Molecular Function ）三個部分。 GO 功能富集以 padj 小于 0.05 作為為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果見結(jié)果文件。

??從 GO 富集分析結(jié)果中，選取最顯著的 30 個 Term 繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足 30 個，則繪制所有 Term ，按生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別及差異基因上下調(diào)分類畫的柱狀圖。

??有向無環(huán)圖 (Directed Acyclic Graph，DAG) 為差異基因 GO 富集分析結(jié)果的圖形化展示方式。圖中，分支代表包含關(guān)系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，選取每個差異比較組合的 GO 富集結(jié)果最顯著性前 5 位的 GO Term 作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點，并通過包含關(guān)系，將相關(guān)聯(lián)的 GO Term 一起展示，顏色的深淺代表富集程度。我們的項目中分別繪制生物過程、分子功能和細(xì)胞組分的 DAG 圖。

圖 6 GO富集分析柱狀圖

圖中縱坐標(biāo)為GO Term，橫坐標(biāo)為GO Term富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著

圖 7 GO富集分析散點圖

圖中橫坐標(biāo)為注釋到GO Term上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為GO Term

圖 8 GO富集分析DAG圖

每個節(jié)點代表一個GO術(shù)語，方框代表的是富集程度為TOP5的GO，顏色的深淺代表富集程度，顏色越深就表示富集程度越高，每個節(jié)點上展示了該TERM的名稱及富集分析的padj

2.4.3. KEGG通路富集分析

?? KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。 KEGG 通路富集以 padj 小于 0.05 作為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果見結(jié)果文件。

??從 KEGG 富集結(jié)果中，選取最顯著的 20 個 KEGG 通路繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足 20 個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標(biāo)為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標(biāo)為 KEGG 通路。

??從 KEGG 富集結(jié)果中，選取最顯著的 20個KEGG 通路繪制散點圖進(jìn)行展示，若不足 20 個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標(biāo)為注釋到 KEGG 通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為 KEGG 通路，點的大小代表注釋到 KEGG 通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。

圖 9 KEGG富集分析柱狀圖

圖中橫坐標(biāo)為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標(biāo)為KEGG通路。

圖 10 KEGG富集散點圖

圖中橫坐標(biāo)為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG通路