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項目名稱：RIP測序與分析報告
所屬分類：生物信息學分析-報告解讀
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技術(shù)服務描述
1. 工作流程
??RNA免疫共沉淀（RIP）是一種用于研究蛋白質(zhì)與 RNA 的體內(nèi)相互作用的經(jīng)典實驗技術(shù)。采用特異性抗體將目的蛋白進行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所結(jié)合的RNA片段也富集下來。通過與高通量測序技術(shù)的結(jié)合，對 RIP 后的RNA 產(chǎn)物進行測序分析， 從全基因組范圍內(nèi)尋找目的蛋白的 RNA 結(jié)合位點，以高效率的測序手段得到高通量的數(shù)據(jù)結(jié)果。
1.1. RIP 免疫沉淀實驗流程
??目前主要有兩種不同的RIP 實驗方法，大致流程如下（以細胞樣品的處理過程為例）：
RNA Immunoprecipitation
準備足量的新鮮細胞，每個IP約1x107個細胞，用RIP裂解液裂解細胞
加入2-5ug抗體，抗體與蛋白，4℃孵育過夜
加入proteinA/G磁珠，4℃孵育4-6小時
清洗磁珠。
Proteinase K 解交連。
酚氯仿或RNA提取試劑盒提取RNA
QPCR 檢測或建庫測序
1.2. RIP Sequencing 文庫構(gòu)建流程
用qubit 及2100對RIP片段進行定量及片段長度檢測
加入適當?shù)腗g2+,加熱打斷RNA片段
加入反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄成cDNA
斷裂RNA鏈且以斷裂RNA為引物，cDNA為模版，形成雙鏈DNA
補齊片段末端，并在3’末端加A尾
添加Adapter
0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter
文庫PCR擴增
1XAMPure beads 去掉多余的primer
qPCR測定文庫濃度
Agilent 2100測定文庫片段大小
1.3. 生物信息分析流程
??將測序結(jié)果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續(xù)標準信息分析及個性化分析。信息分析流程如下：
2. 生物信息分析
2.1. RIP Sequencing 文庫質(zhì)檢結(jié)果
??文庫片段質(zhì)檢，RIP文庫的染色質(zhì)片段在150-300bp之間，建庫加入約140bp的接頭后，片段應該分布在300-450bp之間為最好。
Ladder 自下而上依次為 25（綠色），200,500,1000,2000,4000nt
2.2. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制
??對原始測序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估。RIP數(shù)據(jù)一般為雙端測序，因此，每個測序樣本會有兩個測序結(jié)果。
??評估的具體內(nèi)容見：
| 結(jié)果說明 | 結(jié)果路徑 |
|---|---|
| RawData-fastqc 文件鏈接 | /Results/01.qc/qc_rawdata/*.html |
| CleanData-fastqc 文件鏈接 | /Results/01.qc/qc_cleandata/*.html |
| Fastqc 格式補充說明 | /Results/01.qc/qc_Supplement/qc_Supplement.html |
??以上結(jié)果均位于文件夾：/Results/01.qc/
2.3. Peak calling數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果
??質(zhì)檢后的reads，采用trim-galory對reads進行去接頭，去接頭后，再次對reads進行質(zhì)檢，主要檢測接頭是否去除干凈。去除接頭的reads，用hisat2軟件將reads mapping到基因組上，得到reads在基因組上的信息，即.bam文件，將input的.bam文件與IP的.bam文件，通過MASC2進行 peak calling，得到peak文件，即為.bed文件，對得到的peak進行注釋，并進行功能分析。
??采用常用 reads 富集峰鑒定軟件 MACS2 在全基因范圍進行 peak 掃描，得到 Peak 在基因組上的位置信息、peak 富集信息等。
圖 2.4.1 全基因組 Reads 富集峰
??使用Chipseeker對Reads富集峰進行注釋，得到tss上下游3k的基因注釋信息。使用bedtools對富集峰與lncRNA取交集得到所在基因，將得到的lncRNA基因同樣使用chipseeker（僅用 Protein-coding 注釋）進行上下游10k的臨近基因注釋，對基因結(jié)果進行后續(xù)富集分析。
圖 2.4.2 Peak信息anno流程圖
??結(jié)果文件：
| 結(jié)果說明 | 結(jié)果路徑 |
|---|---|
| reads在基因組上的分布信息 | DYQ-HCT116-target.bw |
| callPeak peak信息 | DYQ-HCT116_peaks.bed |
| callPeak tss上下游3k注釋信息 | DYQ-HCT116_peaks.PeakAnno.xls |
| callPeak 與 lncRNA 交集peak信息 | DYQ-HCT116_peaks_lncRNA.bed |
| 交集peak信息與臨近Protein-coding的注釋信息 | Peak_LncRNA_Anno_Protein-coding.xls |
| 交集peak信息與臨近Protein-coding的注釋信息(bed) | Peak_LncRNA_Anno_Protein-coding.bed |
| 注釋信息的基因信息匯總 | gene.list.annoinfo.xls |
??以上結(jié)果均位于文件夾： /Results/02.callPeak
2.4. Peak 基因注釋與 GO 功能分析
??Peak 所在基因進行GO 功能分析，并按照基因功能進行聚類分析。y軸為基因的功能聚類，x軸為基因count數(shù)，顏色為校正p值。GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著性富集的閾值，GO分析有3種類型，分別為CC(細胞組分），MF(分子功能），BP(生物過程）。富集結(jié)果見：
??條形圖縱坐標為GO Term，縱坐標為count數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。
圖 2.5.1 Peak 相關基因的GO 功能富集分析（條形圖）
??氣泡圖縱坐標為GO Term，點的大小代表注釋到GO Term上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小
圖 2.5.2 Peak 相關基因的 GO 功能富集分析（氣泡圖）
結(jié)果文件：
2.5. Peak 基因注釋與 KEGG通路分析
??KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。KEGG通路富集以padj小于0.05作為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果如下表所示，見結(jié)果文件：Enrichment/KEGG。 ?從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制柱狀圖進行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為KEGG通路，縱坐標為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著。
圖 2.6.1 Peak 相關基因的KEGG通路富集分析(條形圖）
??氣泡圖縱坐標為GO Term，點的大小代表注釋到GO Term上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小
圖 2.6.2 Peak 相關基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）
結(jié)果文件：