技術(shù)服務(wù)描述

1. 建庫測序工作流程

1.1. 建庫測序流程

??MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為20-24個核苷酸長度的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，miRNA 是生物體內(nèi)一類重要的特殊分子，誘導(dǎo)基因沉默，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動的調(diào)控過程。

??從RNA樣品到最終分析結(jié)果數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過樣品檢測、建庫、測序和信息分析等過程，其中測序過程我們采用高通量測序illumina HiSeq/MiSeq測序平臺；illumina測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Sequenced Reads），我們稱之為Raw Data或Raw Reads，結(jié)果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式存儲，其中包含測序序列（reads）的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

??樣品質(zhì)量檢測：利用NanoDrop 2000分光光度計對RNA樣品進(jìn)行初步定量，Aglient 2100對樣品濃度精確定量。RNA樣品總量、濃度、完整性（RIN值，RNA Integrity Number）、純度（OD260/OD280比值）符合收樣立項標(biāo)準(zhǔn)后，進(jìn)入下一步的文庫構(gòu)建。

??文庫構(gòu)建：Total RNA PEG (polyethylene glycol)沉淀，連接3’接頭，PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 膠分離回收，連接5’接頭，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，文庫切膠回收。

??文庫質(zhì)檢：Q-PCR方法對文庫進(jìn)行精確定量，文庫有效濃度>2nM即可上機(jī)測序。

??上機(jī)測序：將各文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后，進(jìn)行SE75測序。

圖1: Small RNA 文庫構(gòu)建 Workflow

??Small RNA測序的接頭信息：

??RNA 5‘Adapter (RA5), part:

??5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’

??RNA 3’Adapter (RA3), part:

??5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCT-3’ (1ug流程)

??5’-CTGTAGGCACCATCAATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’ (10ug流程)

2. 信息分析流程

??Raw Data通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染、統(tǒng)計序列長度分布等過程完成初級分析；將初級分析得到的clean reads與ncRNA庫比對，分類注釋ncRNA，并去除reads中的rNRA、tRNA、snRNA、snoRNA等；然后再將reads比對到參考基因組、miRBase上，計算miRNA表達(dá)量，注釋已知miRNA、預(yù)測新的miRNA；然后進(jìn)行差異miRNA、靶基因預(yù)測、功能注釋等后續(xù)分析。

miRNA生物信息分析流程圖

2.1. miRNA-seq 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

2.1.1. 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 及 數(shù)據(jù)過濾

??對于測序得到的rawdata，我們首先使用fastqc進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評估，通過結(jié)果，我們可以了解到測序數(shù)據(jù)reads質(zhì)量、長度、堿基分布，序列重復(fù)頻次等基本信息。

??測序得到的raw data，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，為了保證后續(xù)信息分析的質(zhì)量，必須對raw reads進(jìn)行處理，得到clean reads。

??raw data的過濾步驟如下： 去除低質(zhì)量 reads; 去除有5’接頭污染的reads; 去除沒有3’接頭序列; 去除沒有插入片段的reads; 去除長度小于16nt的reads;

??數(shù)據(jù)經(jīng)過以上過濾后，我們對數(shù)據(jù)做一些基本統(tǒng)計。

結(jié)果：

2.2. 數(shù)據(jù)長度分布

??一般來說，小RNA的長度區(qū)間為18～30nt，數(shù)據(jù)過濾完成后，我們統(tǒng)計了clean reads數(shù)目及各自占總reads的百分比，并繪制reads長度分布圖。reads長度分布圖能幫助我們判斷小RNA的種類，如miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。

Clean Data Reads 長度分布統(tǒng)計直方圖：

Figure 2.2: Small RNA Clean Reads長度分布圖

Clean Reads長度分布直方圖，橫坐標(biāo)為Reads的長度，縱坐標(biāo)為樣品中對應(yīng)該長度的total Reads數(shù)量。

2.3. miRNA基因組比對分析

??我們將Clean Reads 與 mature miRNA, miRNA hairpin, mRNA, mature & primary tRNA, snoRNA, rRNA, other non-coding RNA, and (optional) known RNA 使用bowtie進(jìn)行比對搜索，然后統(tǒng)計reads的比對情況，分析樣本中各類ncRNA的數(shù)目及比例情況，統(tǒng)計結(jié)果如下。過濾出待分析的miRNA以便后續(xù)分析，將clean reads中ncRNA盡可能地去除，便于后續(xù) miRNA 檢測及預(yù)測。

Reads類型分布圖

圖顯示的是各類型的RNA reads和miRNA reads占總distinct reads的比例。

與參考基因組比對質(zhì)控結(jié)果：

2.4. 已知 miRNA 的檢測以及 novel miRNA 預(yù)測分析

??首先用去除了ncRNA后的Reads比對miRbase數(shù)據(jù)庫，比對上miRbase中 reads 用于檢測已知成熟的miRNA，并統(tǒng)計其表達(dá)量和RPM值。我們采用miRge軟件來進(jìn)行 miRNA reads 檢測注釋、novel miRNA的預(yù)測、miRNA表達(dá)量的統(tǒng)計。

miRNA分析結(jié)果匯總：

以上miRNA各圖的可視化網(wǎng)頁：02.miRNA/miR_visualization.html

2.4.1. miRNA異構(gòu)體分析

??隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，早期認(rèn)為的miRNA loci僅產(chǎn)生1條miRNA成熟體序列這一觀點被顛覆。對于某一miRNA來說，它并不是單一的序列，而是由一系列長度/序列及表達(dá)不同的異構(gòu)體 (isomiRs) 組成。這些isomiRs表達(dá)多樣且序列多樣，甚至引入多樣的5'端及種子區(qū)域。特定miRNA位點在疾病組織中可具有異常的表達(dá)模式，現(xiàn)已證實，部分isomiRs具有重要的生物學(xué)功能。

??IsomiRs目前主要分為三類：5′isomiRs, 3′isomiRs, polymorphic isomiRs。IsomiRs的產(chǎn)生機(jī)制主要有：miRNA加工和成熟過程中Darsha和Dicer酶的不精確或選擇性剪切；3'端核苷酸添加；RNA編輯和單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide polymorphism，SNP)。主要表現(xiàn)為：5'端修剪；3' 端修剪；3'端核苷酸附加和堿基替換。其中，5'端修剪和堿基替換可發(fā)生在種子區(qū)域內(nèi)部，產(chǎn)生“種子轉(zhuǎn)移”（seed shifting）。

??我們通過序列與miRbase比對的情況，將各個miRNA Reads進(jìn)行isomiR識別，并同時匯總至miRNA reads 注釋結(jié)果中，分類統(tǒng)計，并選取表達(dá)量較高的前20個mirna進(jìn)行各類IsomiRs表達(dá)豐度統(tǒng)計。

圖2.4.1 所有樣本的變體類型分布（isomiRs）

圖2.4.2 各個樣本的變體分布TOP20的豐度統(tǒng)計

2.4.2. miRNA 堿基編輯

??成熟miRNA序列的第2-8個堿基被稱作“種子”序列，保守性很高。若在這一區(qū)域發(fā)生堿基突變，則可能改變miRNA的靶基因作用位點。我們通過將miRNA序列與miRBase中已知miRNA前體以及成熟miRNA序列進(jìn)行比對(只允許一個位點的錯配)找出發(fā)生了堿基突變的miRNA，統(tǒng)計匯總在該miRNA的堿基突變位點，以及發(fā)生堿基編輯的Reads數(shù)量及百分比，并對統(tǒng)計概況結(jié)果進(jìn)行可視化。

圖2.4.3 鑒定為已存在mirna堿基編輯的在各個樣本中的相應(yīng)readCount占比統(tǒng)計圖

miRNA堿基編輯分析結(jié)果詳細(xì)說明：

1. A2I在各個樣本中統(tǒng)計匯總表

   表頭	說明
   miRNA	miRNA的名稱
   A-to-I position in the miRNA	A2I檢測位置，即序列的第幾個堿基
   miRNA sequence	miRNA的序列
   Sample.readCount	該樣本miRNA的所有序列的readCount總和
   Sample.readCount.canonical	該樣本miRNA的所有序列的readCount總和(篩選低質(zhì)量后)
   Sample.RPM.canonical	該樣本miRNA的所有序列的readCount總和(篩選低質(zhì)量后)的RPM值
   Sample.readCount.mismatch	A2I檢測的序列readCount總和
   Sample.RPM.mismatch	A2I檢測的序列readCount總和的RPM值
   Sample.AtoI.percentage	A2I檢測的序列readCount占比，計算方法為： Sample.readCount.mismatch/Sample.readCount.canonical*100%
   Sample.AtoI.adjusted.pValue	A2I檢測的置信度計算

   
   

• 結(jié)果文件：02.miRNA/2.a2IEditing/a2IEditing.report.csv

• 表頭說明：

2. A2I在各個樣本中統(tǒng)計匯總表的篩選及簡化信息
   ( 即匯總表的*.RPM.mismatch、*.AtoI.percentage列，該表對應(yīng)上面的可視化結(jié)果 )

   表頭	說明
   miRNA:position	miRNA和position位置信息
   sample	樣本名
   A-to-I percentage	A2I檢測的序列readCount占比，對應(yīng)第一個表中的 Sample.AtoI.percentage
   log2RPM	A2I檢測的序列readCount總和的log2RPM值，對應(yīng)第一個表中的A2I檢測的序列 readCount總和的RPM值Sample.RPM.mismatch，進(jìn)行l(wèi)og2計算

   
   

• 結(jié)果文件：02.miRNA/2.a2IEditing/a2IEditing.report.newform.csv

• 表頭說明：

3. A2I分析的序列及統(tǒng)計詳情信息

• 每一個miRNA塊，包含3小塊內(nèi)容：原始序列、篩選后的序列統(tǒng)計、篩選后的序列。重復(fù)的miRNA塊代表不同樣本，順序為 A2I在各個樣本中統(tǒng)計匯總表 的樣本信息。

• 每一行序列包含3個信息， miRNA sequence（reads序列），*.readCount（Count計數(shù)），Filter（是否篩選到后續(xù)進(jìn)行堿基編輯分析）

• 結(jié)果文件：02.miRNA/2.a2IEditing/a2IEditing.detail.txt

• 結(jié)果說明：

2.4.3. novel miRNA 預(yù)測及二級結(jié)構(gòu)分析

??miRge根據(jù)序列特征，堿基配對原則，最小自由能等特征模型，進(jìn)行新穎的miRNA及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。預(yù)測示意圖如下。結(jié)果見：02.miRNA/3.novel_predict/

圖2.4.4 新miRNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測示意圖

2.5. miRNA 定量分析

2.5.1. 樣本間相關(guān)性分析

??生物學(xué)重復(fù)通常是任何生物學(xué)實驗所必須的，目前主流期刊也基本要求生物學(xué)重復(fù)。生物學(xué)重復(fù)主要有兩個用途：一個是證明所涉及的生物學(xué)實驗操作不是偶然，而是可重復(fù)的。另一個是為了確保后續(xù)的差異分析得到更可靠的結(jié)果。樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達(dá)模式的相似度越高。Encode計劃建議皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方(R²)大于0.92(理想的取樣和實驗條件下)。具體的項目操作中，我們要求生物學(xué)重復(fù)樣品間R²至少要大于0.8，否則需要對樣品做出合適的解釋，或者重新進(jìn)行實驗。根據(jù)各樣本所有基因的表達(dá)值計算組內(nèi)及組間樣本的相關(guān)性系數(shù)，繪制成熱圖，可直觀顯示組間樣本差異及組內(nèi)樣本重復(fù)情況。樣本間相關(guān)性系數(shù)越高，其表達(dá)模式越為接近，樣本相關(guān)性熱圖如下圖所示。

圖 2.5.1. 樣本間相關(guān)性熱圖

圖中橫縱坐標(biāo)為各樣本相關(guān)系數(shù)的平方

結(jié)果文件：

樣本間相關(guān)性熱圖結(jié)果：04.DE/Quant/cor_pheatmap*

2.5.2. 主成分分析

??主成分分析（PCA）也常用來評估組間差異及組內(nèi)樣本重復(fù)情況，PCA采用線性代數(shù)的計算方法，對數(shù)以萬計的基因變量進(jìn)行降維及主成分提取。我們對所有樣本的基因表達(dá)值進(jìn)行PCA分析，如下圖所示。理想條件下，PCA圖中，組間樣本應(yīng)該分散，組內(nèi)樣本應(yīng)該聚在一起。

圖 2.5.2. 主成分分析結(jié)果圖

圖中橫坐標(biāo)為第一主成分，縱坐標(biāo)為第二主成分

結(jié)果文件：

主成分分析結(jié)果：04.DE/Quant/pca*

2.6. miRNA 差異分析

??基因表達(dá)定量完成后，需要對其表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選樣本在不同狀態(tài)下表達(dá)水平顯著差異的基因。差異分析主要分為三個步驟。

• 首先對原始的readcount進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（normalization），主要是對測序深度的校正。

• 然后統(tǒng)計學(xué)模型進(jìn)行假設(shè)檢驗概率（pvalue）的計算

• 最后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正，得到FDR值（錯誤發(fā)現(xiàn)率，padj是其常見形式)^[1-2]。

??針對不同的實驗情況，我們選用合適的軟件進(jìn)行基因表達(dá)差異顯著性分析，具體如下表所示。

??若按照以上標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的差異基因過少（低于100），很有可能導(dǎo)致后面的功能富集分析沒有顯著性結(jié)果，所以，我們會根據(jù)項目的具體情況，適當(dāng)?shù)亟档秃Y選差異基因的閾值標(biāo)準(zhǔn)。若項目實驗只關(guān)注某幾個基因的表達(dá)情況（如基因敲除），不在意富集結(jié)果，從下面的差異分析表格中篩選關(guān)注的那幾個基因即可。

??一般來說，如果一個基因在兩組樣品中的表達(dá)量差異達(dá)到兩倍以上，我們認(rèn)為這樣的基因是具有表達(dá)差異的。為了判斷兩個樣品之間的表達(dá)量差異究竟是由于各種誤差導(dǎo)致的還是本質(zhì)差異，我們需要對所有基因在這兩個樣本中的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗。而轉(zhuǎn)錄組分析是針對成千上萬個基因進(jìn)行的，這樣會導(dǎo)致假陽性的累積，基因數(shù)目越多，假設(shè)檢驗的假陽性累積程度會越高，所以引入padj對假設(shè)檢驗的P-value進(jìn)行校正，從而控制假陽性的比例^[3]。

??差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)是非常重要的，我們給出的標(biāo)準(zhǔn)|log2(FoldChange)| > 1 & padj< 0.05是常用的經(jīng)驗值，在實際項目中可以根據(jù)情況靈活選擇。例如，差異倍數(shù)可以選擇1.5倍，也可以選擇3倍，padj常用的閾值包括0.01、0.05、0.1等。若按照以上標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的差異基因過少，很有可能導(dǎo)致后?的功能富集分析沒有顯著性結(jié)果。若項目實驗只關(guān)注某幾個基因的表達(dá)情況（如基因敲除），不在意富集結(jié)果，從下面的差異分析表格中篩選關(guān)注的那幾個基因即可。反之，如果得到的差異基因數(shù)目過多，不利于后續(xù)目標(biāo)基因的篩選，這個時候可使用更嚴(yán)格的閾值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，則可以使用更嚴(yán)格的閾值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

2.6.1. 差異miRNA的篩選

??通過Deseq2進(jìn)行差異分析，我們通常采用 |log2FC|>1 & padj < 0.05 進(jìn)行差異miRNA的篩選，差異計算結(jié)果如下。

結(jié)果文件：

04.DE/Allgene_anno.xls表頭

2.6.2. 差異miRNA的熱圖聚類

??將所有比較組的差異miRNA取并集之后作為差異miRNA集。兩組以上的實驗，可對差異miRNA集進(jìn)行聚類分析，將表達(dá)模式相近的基因聚在一起。我們采用主流的層次聚類對基因的表達(dá)值進(jìn)行聚類分析，對行（row）進(jìn)行均一化處理（Z-score）。熱圖中表達(dá)模式相近的基因或樣本會被聚集在一起，每個方格中的顏色反映的不是基因表達(dá)值，而是表達(dá)數(shù)據(jù)的行進(jìn)行均一化處理后得到的數(shù)值（一般在-1到1之間），所以熱圖中的顏色只能橫向比較（同一基因在不同樣本中的表達(dá)情況），不能縱向比較（同一樣本不同基因的表達(dá)情況）。結(jié)果文件中既有組間的聚類，也有樣品間的聚類。結(jié)題報告展示了樣品間的聚類，具體如下圖所示。

圖 2.6.2. 差異表達(dá)基因聚類熱圖

圖中橫坐標(biāo)為樣品名，縱坐標(biāo)為差異miRNA歸一化后的數(shù)值，顏色越紅，表達(dá)量越高，越藍(lán)，表達(dá)量越低。

結(jié)果文件：

差異miRNA的熱圖結(jié)果：04.DE/heatmap/

2.6.3. 差異miRNA的火山圖分布

??火山圖可直觀展示每個比較組合的差異miRNA分布情況，如下圖所示。圖中橫坐標(biāo)表示基因在處理和對照兩組中的表達(dá)倍數(shù)變化(log2FoldChange)，縱坐標(biāo)表示基因在處理和對照兩組中表達(dá)差異的顯著性水平(-log10padj或-log10pvalue)。為上調(diào)基因用紅色點表示，下調(diào)基因用藍(lán)色點表示。

圖 2.6.3. 差異miRNA火山圖

圖中橫坐標(biāo)為log2FoldChange值，縱坐標(biāo)為-log10padj或-log10pvalue，藍(lán)色的虛線表示差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)的閾值線

結(jié)果文件：

差異基因的火山圖結(jié)果：04.DE/volcano/

2.7. 靶基因預(yù)測

??miRNA是一類在生物體內(nèi)起到重要調(diào)控作用的的小片段非編碼RNA。一般認(rèn)為miRNA通過和mRNA的結(jié)合，可以抑制mRNA的表達(dá)，從而影響到Gene的表達(dá)。

2.7.1. 靶基因預(yù)測結(jié)果

??目前miRNA的靶基因預(yù)測軟件主要是依據(jù)miRNA與其靶位點的互補性、miRNA與其靶位點的調(diào)控關(guān)系、miRNA靶位點的保守性、miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性及附近序列的二級結(jié)構(gòu)等原則設(shè)計的。 目前miRNA預(yù)測主要基于算法預(yù)測，目前也有一部分以實驗結(jié)果為收集對象的數(shù)據(jù)庫。使用算法預(yù)測的數(shù)據(jù)庫，有如 TargetScan、miRDB、RNAhybrid、DIANA-microT-CDS 等。以實驗實驗驗證的收集的靶標(biāo)相互作用數(shù)據(jù)庫，有如 miRTarBase、Tarbase v8 等。 考慮到研究時效性，我們選擇基于miRbase22為基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)庫，在此基礎(chǔ)上篩選出近5年內(nèi)較新的數(shù)據(jù)庫。

??其中，miRDB數(shù)據(jù)庫 是根據(jù) “miRNA通過下調(diào)其靶基因的表達(dá)” miRNA主要功能特征，采用機(jī)器學(xué)習(xí)來進(jìn)行模型預(yù)測得到的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。它通過采用大量RNA數(shù)據(jù)集，使用 “過表達(dá)的miRNA“ 及 “下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本” 進(jìn)一步量化miRNA靶向下調(diào)的特征，采用SVM算法開發(fā)了預(yù)測模型 MirTarget。 該算法結(jié)合實驗數(shù)據(jù)同時比較 TargetScan，DIANA-MicroT，miRanda 和 PITA 另外四種預(yù)測算法，獲得了最優(yōu)表現(xiàn)。 該模型對于每個候選靶標(biāo)基因，它都會生成由SVM計算出的概率分?jǐn)?shù)，該分?jǐn)?shù)反映了預(yù)測結(jié)果的統(tǒng)計置信度，分?jǐn)?shù)越高，置信度越高。所有預(yù)測目標(biāo)的目標(biāo)預(yù)測分?jǐn)?shù)在50到100之間，一般而言，預(yù)測得分 > 80 的預(yù)測目標(biāo)具有較高的可信度。如果分?jǐn)?shù)低于60，則需要謹(jǐn)慎選擇，一般需要提供其他證據(jù)支持。

??TargetScan數(shù)據(jù)庫 則基于序列互補原則，找到比對到靶 3'UTR 的保守性 8 mer、7 mer 或 6 mer 位點（seed match 序列），進(jìn)一步根據(jù)熱力學(xué)穩(wěn)定性篩選得到 miRNA 的靶基因。 隨后，對于不具備保守性的 seed match 區(qū)域計算相應(yīng)的 context score。 將保守和不保守區(qū)域的 context score 進(jìn)行排序即得到 context score percentile。 一般考慮 context score percentile > 90 為預(yù)測的可能具有功能的 miRNA 的靶基因。

??綜上，miRDB數(shù)據(jù)庫主要通過miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系來進(jìn)行量化計算，而TargetScan通過序列互補原則篩選后再進(jìn)行熱穩(wěn)定性量化計算，前者相較于后者更有說服力，而后者得到的數(shù)據(jù)較為全面。我們綜合兩者，通過標(biāo)準(zhǔn) miRDB Score >= 80 & TargetScan context score percentile >= 90 的靶基因作為預(yù)測結(jié)果。通過預(yù)測給出的miRNA-靶基因?qū)?，用于后續(xù)進(jìn)一步網(wǎng)絡(luò)圖或富集分析。

圖 2.7.1. TargetScan vs miRDB 的靶基因交集veen圖

結(jié)果文件：

• miRDB/TargetScan預(yù)測結(jié)果：

  結(jié)果說明	結(jié)果文件
  miRDB預(yù)測結(jié)果（原始）	05.Target/*/Res_miRDB/Res_*.xls
  miRDB預(yù)測結(jié)果（miRDB Score >= 80過濾后）	05.Target/*/Res_miRDB/Res_*.sig.xls
  miRDB預(yù)測結(jié)果（過濾情況統(tǒng)計）	05.Target/*/Res_miRDB/Res_*.Summary.xls
  TargetScan預(yù)測結(jié)果（原始）	05.Target/*/Res_TargetScan/Res_*.xls
  TargetScan預(yù)測結(jié)果（TargetScan score >= 90過濾后）	05.Target/*/Res_TargetScan/Res_*.sig.xls
  TargetScan預(yù)測結(jié)果（過濾情況統(tǒng)計）	05.Target/*/Res_TargetScan/Res_*.Summary.xls

• miRDB/TargetScan預(yù)測結(jié)果過濾后的交集結(jié)果：

  結(jié)果說明	結(jié)果文件
  miRDB/TargetScan兩者過濾后預(yù)測結(jié)果交集統(tǒng)計（總表）	05.Target/*/Compare/Compare_diffMirna2_ALL.xls
  miRDB/TargetScan兩者過濾后預(yù)測結(jié)果交集統(tǒng)計（僅共存的） （當(dāng)兩者中出現(xiàn)僅有一個軟件有結(jié)果時，則按一個軟件篩選）	05.Target/*/Compare/Compare_diffMirna2.xls
  僅共存列表的各個miRNA的靶基因數(shù)量統(tǒng)計	05.Target/*/Compare/Compare_Summary_miRNA.xls
  僅共存列表的各個靶基因的相應(yīng)miRNA數(shù)量統(tǒng)計	05.Target/*/Compare/Compare_Summary_SYMBOL.xls
  交集veen統(tǒng)計文件夾	05.Target/*/Compare/veen

以上結(jié)果均位于文件夾： 05.Target/

Results/05.Target/Compare/veen/ 交集veen統(tǒng)計文件夾說明

2.8. 富集分析

??我們根據(jù)基因表達(dá)量分析得到差異基因之后，必須進(jìn)一步落到基因的功能上來。對于轉(zhuǎn)錄組分析而言，往往涉及到成千上萬個基因，這會使分析變得很復(fù)雜。解決思路是將一個基因列表分成多個部分，從而減少分析的復(fù)雜度。為了解決怎么分成不同類，通常會對基因功能進(jìn)行富集分析, 期望發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用的生物通路, 從而揭示和理解生物學(xué)過程的基本分子機(jī)制。功能富集分析可以將成百上千個基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以減少分析的復(fù)雜度。另外，在兩種不同實驗條件下，激活的通路顯然比簡單的基因或蛋白列表更有說服力?；蚬δ芨患治鍪紫纫獦?gòu)建基因集（gene set，如GO和KEGG數(shù)據(jù)庫等），也就是基因組注釋信息進(jìn)行分類。然后再把我們的目標(biāo)基因集（差異基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意區(qū)分注釋與富集。

??我們采用clusterProfiler軟件對差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得差異基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集，背景基因集為所有進(jìn)行差異顯著分析的基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集。富集分析結(jié)果是對每個差異比較組合的所有差異基因集、上調(diào)差異基因集、下調(diào)差異基因集進(jìn)行富集。本報告中展示的表格是選取某一個比較組合的富集分析結(jié)果，圖片是所有組合的富集分析結(jié)果。

圖 2.8.1. 基因富集分析原理圖

2.8.1. 富集分析結(jié)果文件

結(jié)果文件夾：

• 分析結(jié)果文件夾：06.ENRICH/

• 以上富集分析各圖的可視化網(wǎng)頁：all-pdf.html、up-pdf.html、down-pdf.html

表頭說明： （Results/*enrich_*/gene.ego_*.csv GO富集結(jié)果列表）

表頭說明： （Results/*enrich_*/gene.KEGG*.csv KEGG富集結(jié)果列表）

2.8.2. GO功能富集分析

??GO(Gene Ontology)是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，可分為生物過程（biological process）和細(xì)胞組成（cellular component）分子功能（Molecular Function）三個部分。GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果見結(jié)果文件。

??從GO富集分析結(jié)果中，選取最顯著的30個Term繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足30個，則繪制所有Term，按生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別及差異基因上下調(diào)分類畫的柱狀圖。

??有向無環(huán)圖(Directed Acyclic Graph，DAG)為差異基因GO富集分析結(jié)果的圖形化展示方式。圖中，分支代表包含關(guān)系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，選取每個差異比較組合的GO富集結(jié)果最顯著性前5位的GO Term作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點，并通過包含關(guān)系，將相關(guān)聯(lián)的GO Term一起展示，顏色的深淺代表富集程度。我們的項目中分別繪制生物過程、分子功能和細(xì)胞組分的DAG圖。

圖 2.8.2.1. GO富集分析柱狀圖

圖中縱坐標(biāo)為GO Term，橫坐標(biāo)為GO Term富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著

圖 2.8.2.2. GO富集分析散點圖

圖中橫坐標(biāo)為注釋到GO Term上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為GO Term

圖 2.8.2.3. GO富集分析DAG圖

每個節(jié)點代表一個GO術(shù)語，方框代表的是富集程度為TOP5的GO，顏色的深淺代表富集程度，顏色越深就表示富集程度越高，每個節(jié)點上展示了該TERM的名稱及富集分析的padj

2.8.3. KEGG通路富集分析

??KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。KEGG通路富集以padj小于0.05作為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果見結(jié)果文件。

??從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標(biāo)為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標(biāo)為KEGG通路。

??從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖進(jìn)行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標(biāo)為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG通路，點的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。

圖 2.8.3.1. KEGG富集分析柱狀圖

圖中橫坐標(biāo)為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標(biāo)為KEGG通路。

圖 2.8.3.2. KEGG富集散點圖

圖中橫坐標(biāo)為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG通路