技術(shù)服務(wù)描述

1. 建庫測序流程

1.1. Total RNA 樣品制備和檢測

(1)使用 NanoDrop 2000 分光光度計對 RNA 樣品進行初步定量；

(2)使用 Aglient 2100 對 RNA 樣品濃度精確定量。 RNA 總量、濃度、完整性 （RIN 值，RNA Integrity Number）、純度（OD260/OD280 比 值）符合收樣立項標(biāo)準(zhǔn)后，進入下一步的文庫構(gòu)建。

1.2. 文庫構(gòu)建和上機測序

1.2.1. 鏈特異性文庫

文庫構(gòu)建： 首先用試劑盒去除 rRNA， 將 RNA 打斷成短片段。以 RNA 為模板，用 六堿基隨機引物合成 first strand cDNA， 然后加入緩沖液、dNTPs（dUTP、dATP、dGTP 和 dCTP）和酶合成 second strand cDNA， 然后純化雙鏈 cDNA。純化的雙鏈 cDNA 先進行末 端修復(fù)并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇。之后降解含有 U 堿基 的 cDNA 第二鏈， 最后進行 PCR 富集， 純化 PCR 產(chǎn)物，得到最終的鏈特異性文庫。

1.2.2. 上機測序

文庫構(gòu)建完成后，先使用 Qubit 2.0 進行初步定量，隨后使用 Agilent 2100 對文庫的 insert size 進行檢測，insert size 符合預(yù)期后，使用 qPCR 方法對文庫的有效濃度（>2 nM）進行 準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后，進行 PE125 或 PE150 測序。

2. 分析流程