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項(xiàng)目名稱：micRNA建庫(kù)與分析流程
所屬分類：生物信息學(xué)分析
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技術(shù)服務(wù)描述
建庫(kù)測(cè)序流程
??MicroRNA (miRNA) 是一類長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，miRNA 是生物體內(nèi)一類重要的特殊分子，誘導(dǎo)基因沉默，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動(dòng)的調(diào)控過(guò)程。
??從RNA樣品到最終分析結(jié)果數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過(guò)樣品檢測(cè)、建庫(kù)、測(cè)序和信息分析等過(guò)程，其中測(cè)序過(guò)程我們采用高通量測(cè)序illumina HiSeq/MiSeq測(cè)序平臺(tái)；illumina測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列（Sequenced Reads），我們稱之為Raw Data或Raw Reads，結(jié)果以FASTQ（簡(jiǎn)稱為fq）文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列（reads）的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。
??樣品質(zhì)量檢測(cè)：利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)對(duì)RNA樣品進(jìn)行初步定量，Aglient 2100對(duì)樣品濃度精確定量。RNA樣品總量、濃度、完整性（RIN值，RNA Integrity Number）、純度（OD260/OD280比值）符合收樣立項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)后，進(jìn)入下一步的文庫(kù)構(gòu)建。
??文庫(kù)構(gòu)建：Total RNA PEG (polyethylene glycol)沉淀，連接3’接頭，PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 膠分離回收，連接5’接頭，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增，文庫(kù)切膠回收。
??文庫(kù)質(zhì)檢：Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行精確定量，文庫(kù)有效濃度>2nM即可上機(jī)測(cè)序。
??上機(jī)測(cè)序：將各文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后，進(jìn)行SE75測(cè)序。
圖1: Small RNA 文庫(kù)構(gòu)建 Workflow
??Small RNA測(cè)序的接頭信息：
??RNA 5‘Adapter (RA5), part:
??5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC-3’
??RNA 3’Adapter (RA3), part:
??5’-AGATCGGAAGAGCACACGTCT-3’ (1ug流程)
??5’-CTGTAGGCACCATCAATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3’ (10ug流程)
信息分析流程
??Raw Data通過(guò)去接頭、去低質(zhì)量、去污染、統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度分布等過(guò)程完成初級(jí)分析；將初級(jí)分析得到的clean reads與ncRNA庫(kù)比對(duì)，分類注釋ncRNA，并去除reads中的rNRA、tRNA、snRNA、snoRNA等；然后再將reads比對(duì)到參考基因組、miRBase上，計(jì)算miRNA表達(dá)量，注釋已知miRNA、預(yù)測(cè)新的miRNA；然后進(jìn)行差異miRNA、靶基因預(yù)測(cè)、功能注釋等后續(xù)分析。
miRNA生物信息分析流程圖
