技術(shù)服務(wù)描述

項目信息

合同編號：DEMO-2021-01-29-xx

客戶姓名：Client-name

客戶單位：Unit-address

1. 分析流程

1.1. 建庫測序流程

??從RNA樣品提取到最終數(shù)據(jù)獲得，樣品檢測、建庫、測序等每一環(huán)節(jié)都會直接影響數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量，從而影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。為從源頭保證測序數(shù)據(jù)準確可靠，在數(shù)據(jù)的所有生產(chǎn)環(huán)節(jié)都嚴格把關(guān)，從根源上確保高質(zhì)量數(shù)據(jù)的產(chǎn)出。建庫測序的流程：

1. Total RNA 樣本檢測

2. RNA 富集

3. 雙鏈cDNA合成

4. 末端修復(fù)、加A和接頭

5. 片段選擇和 PCR 擴增

6. 文庫質(zhì)檢

7. Illumina測序

1.2. 信息分析流程

??RNA-seq的核心是基因表達差異的顯著性分析，使用統(tǒng)計學(xué)方法，比較兩個條件或多個條件下的基因表達差異，從中找出與條件相關(guān)的特異性基因，然后進一步分析這些特異性基因的生物學(xué)意義，分析過程包括質(zhì)控、比對、定量、差異顯著性分析、功能富集等環(huán)節(jié)。信息分析流程如下圖所示：

2. 信息分析

2.2. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

對原始測序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估。測序數(shù)據(jù)一般為雙端測序，因此，每個測序樣本會有兩個測序結(jié)果。

評估的具體內(nèi)容見：

RawData-fastqc 文件鏈接： /result/qc/qc_rawdata/*.html
CleanData-fastqc 文件鏈接： /result/qc/qc_cleandata/*.html
Fastqc 格式補充說明： /result/qc/qc_Supplement.html

2.3. 參考基因組比對

??測序片段（fragments）是mRNA隨機打斷的，為了確定這些一段由哪些基因轉(zhuǎn)錄來，需要將質(zhì)控后的clean reads比對到參考基因組上。使用HISAT2軟件將Clean Reads與參考基因組進行快速精確的比對，獲取Reads在參考基因組上的定位信息^[4]。HISAT2軟件官方手冊。

??如果參考基因組組裝的較為完善，而且所測物種與參考基因組一致，且相關(guān)實驗不存在污染，那么實驗所產(chǎn)生的測序reads成功比對到基因組的比例會高于70% (Total Mapped Reads or Fragments)。本項目所用參考基因組為 hg38 ，下載鏈接：Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz 。

結(jié)果文件：

各個樣本的比對情況統(tǒng)計文件：/result/map_stat/*.flagstat.txt

2.4. 定量分析

2.4.1. 樣本間相關(guān)性

??生物學(xué)重復(fù)通常是任何生物學(xué)實驗所必須的，目前主流期刊也基本要求生物學(xué)重復(fù)。生物學(xué)重復(fù)主要有兩個用途：一個是證明所涉及的生物學(xué)實驗操作不是偶然，而是可重復(fù)的。另一個是為了確保后續(xù)的差異基因分析得到更可靠的結(jié)果。樣品間基因表達水平相關(guān)性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達模式的相似度越高。Encode計劃建議皮爾遜相關(guān)系數(shù)的平方(R²)大于0.92(理想的取樣和實驗條件下)。具體的項目操作中，我們要求生物學(xué)重復(fù)樣品間R²至少要大于0.8，否則需要對樣品做出合適的解釋，或者重新進行實驗。根據(jù)各樣本所有基因的表達值計算組內(nèi)及組間樣本的相關(guān)性系數(shù)，繪制成熱圖，可直觀顯示組間樣本差異及組內(nèi)樣本重復(fù)情況。樣本間相關(guān)性系數(shù)越高，其表達模式越為接近，樣本相關(guān)性熱圖如下圖所示。

圖 1 樣本間相關(guān)性熱圖

圖中橫縱坐標為各樣本相關(guān)系數(shù)的平方

結(jié)果文件：

樣本間相關(guān)性熱圖結(jié)果：Quant/cor_pheatmap*

2.4.2. 主成分分析

??主成分分析（PCA）也常用來評估組間差異及組內(nèi)樣本重復(fù)情況，PCA采用線性代數(shù)的計算方法，對數(shù)以萬計的基因變量進行降維及主成分提取。我們對所有樣本的基因表達值進行PCA分析，如下圖所示。理想條件下，PCA圖中，組間樣本應(yīng)該分散，組內(nèi)樣本應(yīng)該聚在一起。

圖 2 主成分分析結(jié)果圖

圖中橫坐標為第一主成分，縱坐標為第二主成分

結(jié)果文件：

主成分分析結(jié)果：Quant/pca*

2.5. 差異分析

??基因表達定量完成后，需要對其表達數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選樣本在不同狀態(tài)下表達水平顯著差異的基因。差異分析主要分為三個步驟。

• 首先對原始的readcount進行標準化（normalization），主要是對測序深度的校正。

• 然后統(tǒng)計學(xué)模型進行假設(shè)檢驗概率（pvalue）的計算

• 最后進行多重假設(shè)檢驗校正，得到FDR值（錯誤發(fā)現(xiàn)率，padj是其常見形式)^[1-2]。

??針對不同的實驗情況，我們選用合適的軟件進行基因表達差異顯著性分析，具體如下表所示。

??若按照以上標準篩選得到的差異基因過少（低于100），很有可能導(dǎo)致后面的功能富集分析沒有顯著性結(jié)果，所以，我們會根據(jù)項目的具體情況，適當?shù)亟档秃Y選差異基因的閾值標準。若項目實驗只關(guān)注某幾個基因的表達情況（如基因敲除），不在意富集結(jié)果，從下面的差異分析表格中篩選關(guān)注的那幾個基因即可。

??一般來說，如果一個基因在兩組樣品中的表達量差異達到兩倍以上，我們認為這樣的基因是具有表達差異的。為了判斷兩個樣品之間的表達量差異究竟是由于各種誤差導(dǎo)致的還是本質(zhì)差異，我們需要對所有基因在這兩個樣本中的表達量數(shù)據(jù)進行假設(shè)檢驗。而轉(zhuǎn)錄組分析是針對成千上萬個基因進行的，這樣會導(dǎo)致假陽性的累積，基因數(shù)目越多，假設(shè)檢驗的假陽性累積程度會越高，所以引入padj對假設(shè)檢驗的P-value進行校正，從而控制假陽性的比例^[3]。

??差異基因的篩選標準是非常重要的，我們給出的標準|log2(FoldChange)| > 1 & padj< 0.05是常用的經(jīng)驗值，在實際項目中可以根據(jù)情況靈活選擇。例如，差異倍數(shù)可以選擇1.5倍，也可以選擇3倍，padj常用的閾值包括0.01、0.05、0.1等。若按照以上標準篩選得到的差異基因過少，很有可能導(dǎo)致后?的功能富集分析沒有顯著性結(jié)果。若項目實驗只關(guān)注某幾個基因的表達情況（如基因敲除），不在意富集結(jié)果，從下面的差異分析表格中篩選關(guān)注的那幾個基因即可。反之，如果得到的差異基因數(shù)目過多，不利于后續(xù)目標基因的篩選，這個時候可使用更嚴格的閾值標準進行篩選，則可以使用更嚴格的閾值標準進行篩選。

2.5.1. 差異基因的篩選

??通過Deseq2進行差異分析，我們通常采用 |log2FC|>1 & padj < 0.05 進行差異基因的篩選，隨后對差異基因進行注釋，得到包含注釋信息的差異基因列表。

結(jié)果文件：

差異基因列表及相關(guān)注釋信息（總的結(jié)果）：result/Enrichment/Allgene_anno_ALL.xls
差異基因列表及相關(guān)注釋信息（篩選結(jié)果）：result/Enrichment/Allgene_anno.xls

Differential/Allgene_anno*.xls表頭

2.5.2. 差異基因的熱圖聚類

??將所有比較組的差異基因取并集之后作為差異基因集。兩組以上的實驗，可對差異基因集進行聚類分析，將表達模式相近的基因聚在一起。我們采用主流的層次聚類對基因的表達值進行聚類分析，對行（row）進行均一化處理（Z-score）。熱圖中表達模式相近的基因或樣本會被聚集在一起，每個方格中的顏色反映的不是基因表達值，而是表達數(shù)據(jù)的行進行均一化處理后得到的數(shù)值（一般在-1到1之間），所以熱圖中的顏色只能橫向比較（同一基因在不同樣本中的表達情況），不能縱向比較（同一樣本不同基因的表達情況）。結(jié)果文件中既有組間的聚類，也有樣品間的聚類。結(jié)題報告展示了樣品間的聚類，具體如下圖所示。

圖 3 差異表達基因聚類熱圖

圖中橫坐標為樣品名，縱坐標為差異基因歸一化后的數(shù)值，顏色越紅，表達量越高，越藍，表達量越低。

結(jié)果文件：

差異基因的熱圖結(jié)果：Differential/heatmap/

2.5.3. 差異基因的火山圖分布

??火山圖可直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，如下圖所示。圖中橫坐標表示基因在處理和對照兩組中的表達倍數(shù)變化(log2FoldChange)，縱坐標表示基因在處理和對照兩組中表達差異的顯著性水平(-log10padj或-log10pvalue)。為上調(diào)基因用紅色點表示，下調(diào)基因用藍色點表示。

圖 4 差異基因火山圖

圖中橫坐標為log2FoldChange值，縱坐標為-log10padj或-log10pvalue，藍色的虛線表示差異基因篩選標準的閾值線

結(jié)果文件：

差異基因的火山圖結(jié)果：Differential/volcano/volcano.png

2.6. 富集分析

??我們根據(jù)基因表達量分析得到差異基因之后，必須進一步落到基因的功能上來。對于轉(zhuǎn)錄組分析而言，往往涉及到成千上萬個基因，這會使分析變得很復(fù)雜。解決思路是將一個基因列表分成多個部分，從而減少分析的復(fù)雜度。為了解決怎么分成不同類，通常會對基因功能進行富集分析, 期望發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用的生物通路, 從而揭示和理解生物學(xué)過程的基本分子機制。功能富集分析可以將成百上千個基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以減少分析的復(fù)雜度。另外，在兩種不同實驗條件下，激活的通路顯然比簡單的基因或蛋白列表更有說服力?；蚬δ芨患治鍪紫纫獦?gòu)建基因集（gene set，如GO和KEGG數(shù)據(jù)庫等），也就是基因組注釋信息進行分類。然后再把我們的目標基因集（差異基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意區(qū)分注釋與富集。

??我們采用clusterProfiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得差異基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集，背景基因集為所有進行差異顯著分析的基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集。富集分析結(jié)果是對每個差異比較組合的所有差異基因集、上調(diào)差異基因集、下調(diào)差異基因集進行富集。本報告中展示的表格是選取某一個比較組合的富集分析結(jié)果，圖片是所有組合的富集分析結(jié)果。

圖 5 基因富集分析原理圖

2.6.1. 富集分析結(jié)果文件

結(jié)果文件夾：

• all 分析結(jié)果文件夾：result/Enrichment/all/

• up 分析結(jié)果文件夾：result/Enrichment/up/

• down 分析結(jié)果文件夾：result/Enrichment/down/

• all 網(wǎng)頁預(yù)覽圖：result/Enrichment/all-pdf.html

• up 網(wǎng)頁預(yù)覽圖：result/Enrichment/up-pdf.html

• down 網(wǎng)頁預(yù)覽圖：result/Enrichment/down-pdf.html

說明：

• all/up/down分別對應(yīng)總差異基因，上調(diào)差異基因，下調(diào)差異基因進行對應(yīng)的富集分析。

表頭說明： （Results/*enrich_*/gene.ego_*.csv GO富集結(jié)果列表）

表頭說明： （Results/*enrich_*/gene.KEGG*.csv KEGG富集結(jié)果列表）

2.6.1. GO功能富集分析

??GO(Gene Ontology)是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，可分為生物過程（biological process）和細胞組成（cellular component）分子功能（Molecular Function）三個部分。GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果見結(jié)果文件。

??從GO富集分析結(jié)果中，選取最顯著的30個Term繪制柱狀圖進行展示，若不足30個，則繪制所有Term，按生物過程、細胞組分和分子功能三大類別及差異基因上下調(diào)分類畫的柱狀圖。

??有向無環(huán)圖(Directed Acyclic Graph，DAG)為差異基因GO富集分析結(jié)果的圖形化展示方式。圖中，分支代表包含關(guān)系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，選取每個差異比較組合的GO富集結(jié)果最顯著性前5位的GO Term作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點，并通過包含關(guān)系，將相關(guān)聯(lián)的GO Term一起展示，顏色的深淺代表富集程度。我們的項目中分別繪制生物過程、分子功能和細胞組分的DAG圖。

圖 6 GO富集分析柱狀圖

圖中縱坐標為GO Term，橫坐標為GO Term富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著

圖 7 GO富集分析散點圖

圖中橫坐標為注釋到GO Term上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為GO Term

圖 8 GO富集分析DAG圖

每個節(jié)點代表一個GO術(shù)語，方框代表的是富集程度為TOP5的GO，顏色的深淺代表富集程度，顏色越深就表示富集程度越高，每個節(jié)點上展示了該TERM的名稱及富集分析的padj

2.6.2. KEGG通路富集分析

??KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。KEGG通路富集以padj小于0.05作為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果見結(jié)果文件。

??從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制柱狀圖進行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標為KEGG通路。

??從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖進行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為KEGG通路，點的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。

圖 9 KEGG富集分析柱狀圖

圖中橫坐標為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標為KEGG通路。

圖 10 KEGG富集散點圖

圖中橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為KEGG通路