技術(shù)服務(wù)描述

Chip差異Peak分析結(jié)果及報(bào)告

1. 概述

1.1. 背景及分析流程簡(jiǎn)介

??為了理解細(xì)胞中更為復(fù)雜的生物過(guò)程，許多研究已在通過(guò)比較ChIP-seq的差異獲得的不同數(shù)據(jù)。越來(lái)越多的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)正在研究多種實(shí)驗(yàn)條件（例如各種治療條件，幾個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)和不同的治療劑量水平）下的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，組蛋白修飾的差異。差異富集在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中已變得具有實(shí)際重要性。 為了建立對(duì)比條件消除誤差，我們對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了以下流程處理：我們首先將A與B兩組的結(jié)果進(jìn)行共有Peak區(qū)域基因計(jì)算，對(duì)于有共有區(qū)域(overlap)的Peak，計(jì)算最高峰位點(diǎn)并向其兩側(cè)各延伸250bp作為合并峰計(jì)算區(qū)域，對(duì)每個(gè)區(qū)域進(jìn)行的每組樣本進(jìn)行reads表達(dá)定量，進(jìn)行差異Peak的計(jì)算，篩選出差異Peak，進(jìn)行臨近3K注釋到基因上，進(jìn)行基因集富集分析。

??本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們處理的是有兩組重復(fù)的DiffPeak數(shù)據(jù)對(duì)比，我們的差異Peak篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2FC| > 1 && FDR < 0.05。

分析流程:

1.2. 結(jié)果匯總

* 以上重要結(jié)果為加粗顯示。

2. 分析流程

2.1. 重疊區(qū)域的計(jì)算

2.1.1. PeakScore相關(guān)性分析

??為了進(jìn)行后續(xù)的差異Peak的富集程度比較，我們需要合并Peak比較區(qū)域，在overlap的共有區(qū)域計(jì)算前，我們需要先了解各組內(nèi)的peak重復(fù)性情況。 對(duì)Treat組和Control組進(jìn)行PeakScore相關(guān)性熱圖分析，PCA分析。

Results/Plot/1cor_peakScore_Demo_A-B.png	Results/Plot/1cor_peakScore_Demo_C-D.png
Results/Plot/1pca_peakScore_Demo_A-B.png	Results/Plot/1pca_peakScore_Demo_C-D.png

2.1.2. readsCount相關(guān)性分析

??我們選取至少含有overlap區(qū)域>=2個(gè)樣本的callPeak區(qū)域結(jié)果，計(jì)算最高峰位點(diǎn)并向其兩側(cè)各延伸250bp作為合并峰計(jì)算區(qū)域，對(duì)每個(gè)區(qū)域每組樣本進(jìn)行reads表達(dá)定量。 隨后，我們對(duì)各組進(jìn)行readsCount的相關(guān)性熱圖分析，PCA分析。

Results/Plot/2cor_readCount_Demo_A-B.png	Results/Plot/2cor_readCount_Demo_C-D.png
Results/Plot/2pca_readCount_Demo_A-B.png	Results/Plot/2pca_readCount_Demo_C-D.png

2.2. 差異Peak的計(jì)算

2.2.1. 差異Peak的相關(guān)性計(jì)算及顯著性差異Peak的篩選

??通過(guò)計(jì)算兩組之間的合并區(qū)域的表達(dá)差異，我們能獲得兩組比較計(jì)算的差異Peak所有結(jié)果。 通過(guò)相關(guān)性熱圖及PCA，可以看出組內(nèi)的差異peak計(jì)算的相關(guān)性好壞，一般而言好的結(jié)果能明顯區(qū)分開。 通過(guò)閾值|log2FC| > 1 & FDR < 0.05進(jìn)行篩選獲得顯著差異Peak篩選結(jié)果，進(jìn)行相關(guān)性熱圖，PCA，火山圖，熱圖繪制如下。

??通過(guò)差異Peak分析，我們得到了基因組范圍內(nèi)的差異Peak信息，為進(jìn)一步得到差異Peak附近的臨近基因信息，我們使用Chipseeker進(jìn)行進(jìn)一步注釋，得到Peak所對(duì)應(yīng)的臨近注釋基因，并給出Peak在Promoter的上下游3k，或之外的Intron、Exon等區(qū)域的位置及距離等信息的注釋文件: Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.xls。

Results/Plot/Demo_A-vs-B_1cor.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_1cor.png
Results/Plot/Demo_A-vs-B_2pca.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_2pca.png
Results/Plot/Demo_A-vs-B_4vol.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_4vol.png
Results/Plot/Demo_A-vs-B_6heatmap.png	Results/Plot/Demo_C-vs-D_6heatmap.png

Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.xls表頭說(shuō)明：

2.2.2. 差異Peak注釋基因的富集分析

??將上述臨近注釋得到的基因集，進(jìn)一步進(jìn)行GO和KEGG富集分析，得到差異Peak篩選結(jié)果的臨近注釋基因富集結(jié)果。結(jié)果文件說(shuō)明及解讀，同CHIP標(biāo)準(zhǔn)分析流程報(bào)告。

??結(jié)果目錄： Results/Enrich/

3. 結(jié)果的IGV可視化

??為了得到較為直觀的測(cè)序分析結(jié)果，我們一般需要借助可視化工具，IGV在這個(gè)過(guò)程中扮演十分出色的角色，他不僅展示了不同樣本測(cè)序覆蓋情況，還常常用于聯(lián)合分析，如mRNA的測(cè)序變化與chip測(cè)序的變化。 在此項(xiàng)目中，我們用于差異Peak的篩選與評(píng)估，我們可將分析結(jié)果文件導(dǎo)入，步驟如下：

1. 導(dǎo)入CHIP分析結(jié)果，即前面我們的Chip標(biāo)準(zhǔn)分析結(jié)果中.bigwig與.narrowPeak文件。

2. 導(dǎo)入CHIP的差異Peak分析結(jié)果，即本分析中所得到的bed結(jié)果。

3. 調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)顯示范圍：

• bigwig 高度范圍顯示調(diào)節(jié)：按住 ctrl / command 選中多個(gè).bigwig文件，右擊點(diǎn)擊 Set Data Range...。 為方便對(duì)比，在對(duì)比不同區(qū)域Peak時(shí)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)顯示范圍。

• bed / gene 重疊區(qū)域展開設(shè)置： 右擊bed文件，點(diǎn)擊 Expanded 設(shè)置展開。

4. 搜索感興趣的 Peakname / SYMBOL： 在第一排第三個(gè)框內(nèi)輸入Peakname / SYMBOL名，點(diǎn)擊GO即可搜索。如果搜索不到，可嘗試點(diǎn)擊Reload重新加載。

篩選的 Peakname / SYMBOL 的一些方法：

• 搜索感興趣的Peak，可參考：Results/*DiffPeakInfo_FC2-q0.05_PeakAnno.sorted.xls，該文件按annotation(Promoter), Fold, FDR列排序， 即Promoter上游3K區(qū)域差異倍數(shù)較大的結(jié)果將被優(yōu)先排序。 排名較前的結(jié)果具有一定的顯著差異Peak篩選價(jià)值。

• 搜索感興趣的Gene，可根據(jù)生物學(xué)功能研究，挑選出較有意義的功能富集結(jié)果的基因集，反向去看差異Peak變化情況。 上述分析的功能富集結(jié)果具有一定的參考意義。

Demo展示：

??一個(gè)示例如下，在該IGV中通過(guò)可視化，可讀出的信息有：在 A vs B 的差異Peak對(duì)比中， Peakname 為 54218, 54219, 54220, 54221 的這些Peak比較區(qū)域， A相對(duì)B具有顯著下調(diào)趨勢(shì)，它們都被臨近注釋到CCL2基因上，注釋類型為3K內(nèi)的Promoter。

示例圖：