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技術(shù)服務(wù)描述

1. Enhancer 與 Super-enhancers

1.1. 增強子（Enhancer）

??所謂增強子（Enhancer），位于結(jié)構(gòu)基因附近，是一類非編碼DNA順式作用元件，在真核生物的發(fā)育過程中通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、輔因子以及染色質(zhì)復(fù)合物作用于啟動子，可以激活或增強基因的轉(zhuǎn)錄。簡單說：增強子是能夠增加啟動子活性從而增加基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列。

??增強子通常具有以下特點： ① 在轉(zhuǎn)錄起始點5'或3'側(cè)均能起作用； ② 相對于啟動子的任一指向均能起作用； ③ 發(fā)揮作用與受控基因的遠近距離相對無關(guān)； ④ 對異源性啟動子也能發(fā)揮作用； ⑤通常具有一些短的重復(fù)順序。

??增強子分為以下兩種類型： ⑴ 細胞特異性增強子：能夠在特定的細胞或特定的細胞發(fā)育階段選擇性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達的增強子稱為細胞特異性增強子。例如，B細胞免疫球蛋白重鏈基因或輕鏈基因的增強子，只有在胚胎干細胞分化為B細胞時，才能對Ig基因起正調(diào)控作用。此外，α-類和β-類珠蛋白基因簇上游非編碼區(qū)中均存在紅細胞系特異性增強子。 ⑵ 誘導(dǎo)性增強子：在特定刺激因子的誘導(dǎo)下，才能發(fā)揮其增強基因轉(zhuǎn)錄活性的增強子稱為誘導(dǎo)性增強子。如激素反應(yīng)元件（HRE）及金屬應(yīng)答元件（MRE）

1.2. 超級增強子（Super-enhancers）

??除了增強子是調(diào)控細胞基因時空表達關(guān)鍵的順式作用元件外，2013年，Richard A. Young 實驗室基于當(dāng)時增強子的研究，提出了超級增強子(Super-enhancers, SEs)概念[1]。超級增強子是具有轉(zhuǎn)錄活性增強子的一個大簇， 富集高密度的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(Master transcription factors)、輔因子(Cofactor)和增強子表觀修飾標記(Histone modification marks)(見圖1)。在功能上超級增強子能夠驅(qū)動控制細胞身份基因的表達，可以用來解釋細胞類型特異的表達模式，在發(fā)育生物學(xué)、癌癥等疾病致病機理研究中顯示出巨大的應(yīng)用潛力[1-4]。胚胎干細胞中的多個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Esrrb、Nr5a2、Prdm14、Tcfcp2l1、Smad3、Stat3、Tcf3）富集在超級增強子上，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細胞中起著十分重要的作用。

??Richard A. Young曾激動地預(yù)言道：“‘超級增強子’具有廣闊的研發(fā)前景和價值，必將成為下一個藥物研發(fā)的黃金靶點！” 因此開展腫瘤相關(guān)超級增強子的研究，將有助深入解開腫瘤發(fā)病機制，并且可用于指導(dǎo)抗腫瘤藥物的高效研發(fā)，具有重要的社會意義和經(jīng)濟價值。

• (a) Enhancers and SEs are occupied by a high density of transcriptional regulators, including transcription factors, coactivators, and the RNA pol II complex.

• (b) A phase separation model of SE activation. High-density interactions between transcriptional regulators form phase-separated multimolecular complexes at the SE locus, leading to the transcription of SE-driven genes.

2. 超級增強子的鑒定

??目前對增強子鑒定，主要采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP-seq） 針對活性增強子相關(guān)聯(lián)的因子或組蛋白修飾進行檢測，如轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔激活因子(如Mediator、p300)、組蛋白修飾H3K27ac 和H3K4me1等?；钚栽鰪娮油ǔＭ瑫r含有H3K27ac 和H3K4me1 修飾，而靜態(tài)增強子(poised enhancer)一般同時具有H3K4me1 和H3K27me3 組蛋白標記[4-6]。在此基礎(chǔ)上，超級增強子依據(jù)增強子轉(zhuǎn)錄活性標記分子結(jié)合水平強度的差異進行鑒定。在分析方法上，首先對所得增強子進行縫合。主要依據(jù)在基因組范圍內(nèi)，這些單個增強子實體間如在12.5 kb 范圍內(nèi)，則合并為單個實體，即縫合增強子(Stitched enhancer)。最后，確定超級增強子和普通增強子之間的閾值?？p合增強子和其余的單個增強子按照ChIP-seq所測信號水平的強度排序，繪制獲得一張曲線圖，該曲線上斜率為1 的切線的切點所得的信號值為區(qū)分超強增強子和普通增強子之間的閾值，高于該值為超級增強子，其余的則稱為普通增強子(Typical enhancer)[1,2]（見圖2，圖3）

總結(jié)下來，識別增強子有以下幾種方法：

• (1) Chip-seq/Chip-chip識別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，

• (2) 增強子特異的因子也可用于識別增強子，如EP300，EP300 的結(jié)合位點常用于預(yù)測增強子；

• (3) RNA 聚合酶 Ⅱ 能與數(shù)千個增強子結(jié)合，所以 RNA 聚合酶 Ⅱ 的最大亞基POLR2A 也可用于尋找增強子位點；

• (4) 脫氧核糖核酸酶 Ⅰ 超敏位點 (DHS) 代表開放染色質(zhì)區(qū)域，許多覆蓋有增強子；

• (5) 甲醛輔助分離調(diào)控元件 (FAIRE) 結(jié)合測序，能識別大量激活調(diào)控元件，包括增強子；

• (6) 一些組蛋白修飾模式反應(yīng)了不同的染色質(zhì)狀態(tài)，如H3K4me1 和 H3K27ac 的結(jié)合廣泛用于增強子的標記；

• (7) 增強子序列能夠轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的增強子RNA(eRNA) 也是激活增強子的標志；

• (8) 染色體 3D 構(gòu)象的方法 (e.g. 5C and ChIA-PET, Capture-C) 也能提供增強子 - 啟動子相互作用的信息。

??鑒定出超級增強子之后，可以根據(jù)基因位置預(yù)測超級增強子所調(diào)控的編碼蛋白基因和非編碼RNA的表達，通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可以對超級增強子和腫瘤異常高表達的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA進行關(guān)聯(lián)分析，從而推斷關(guān)鍵的超級增強子，進一步鎖定腫瘤相關(guān)的基因，有利于指導(dǎo)下一步的抗腫瘤功能研究。

3. 其他資料

定義超級增強子。

• （a） 說明了定義超級增強子的三個步驟。

• 步驟1：通過調(diào)用細胞類型特異性主轉(zhuǎn)錄因子的芯片序列數(shù)據(jù)來定義增強子基因座。

• 步驟2：將12.5kb范圍內(nèi)的增強子組合成縫合的增強子區(qū)域。下一步將使用縫合的增強子區(qū)域和12.5 kb范圍內(nèi)沒有伙伴的增強子來識別超級增強子。

• 步驟3：計算每個增強子區(qū)域（縫合和單個增強子）的Med1的ChIP seq信號。所有增強子區(qū)域都是根據(jù)y軸上的Med1富集度沿x軸排列的。超級增強子定義為結(jié)果曲線拐點右側(cè)的區(qū)域（以灰色突出顯示）。

• （b） 表中總結(jié)了步驟1和3中用于定義不同論文中的超級增強子的所有因子組合，表明在沒有Med1芯片序列數(shù)據(jù)的情況下可以定義超級增強子。

一些案例

文獻：Assessing eRNAs associated with a cytokine-sensing mammary super-enhancer | bioRxiv：

Wap超增強子組成元素中STAT5結(jié)合位點的刪除導(dǎo)致STAT5結(jié)合，H3K27Ac和增強子轉(zhuǎn)錄的減少。

• （A）攜帶單個或多個增強子缺失小鼠的L1乳腺組織中的ChIP-seq顯示了增強子之間的協(xié)同作用，以有效募集STAT5。在位點消除了H3K27Ac所有三種增強子的喪失。

• （B）通過Taqman測定法測量野生型和突變小鼠中的eRNA的表達