技術(shù)服務(wù)描述

circRNA測(cè)序及分析報(bào)告

生信部

2020年12月29日

1. CircRNA背景及分析流程簡(jiǎn)介

1.1. 背景簡(jiǎn)介

??環(huán)形RNA是一類在真核生物中廣泛存在的具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。已有文獻(xiàn)表明，在生物體內(nèi)，環(huán)形RNA有著miRNA海綿、RBP海綿以及翻譯短肽等多項(xiàng)功能，在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 目前研究表明，大部分環(huán)形RNA來(lái)源于蛋白編碼基因的外顯子區(qū)域。在pre-mRNA剪接的過(guò)程中，除典型的內(nèi)含子剪接事件外，還可能會(huì)發(fā)生5’端到3’端的反向剪接事件，從而形成環(huán)形RNA。因此，剪接產(chǎn)物中環(huán)形RNA所占比例是環(huán)形RNA分析的重要指標(biāo)之一，具有高成環(huán)比例的環(huán)形RNA分子，可能具有更加重要的生物學(xué)功能。 同時(shí)，同一基因內(nèi)部也可能產(chǎn)生多種不同的環(huán)形RNA，基因內(nèi)對(duì)環(huán)形RNA產(chǎn)生位點(diǎn)的使用偏好，也在一定程度上反映了轉(zhuǎn)錄過(guò)程對(duì)環(huán)形RNA產(chǎn)生的調(diào)控。因此，環(huán)形RNA轉(zhuǎn)錄本水平的準(zhǔn)確定量，是目前環(huán)形RNA分析的重要基礎(chǔ)。
??為了解決該問(wèn)題，趙方慶團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的環(huán)形RNA分析算法。根據(jù)已有工具鑒定出的環(huán)形RNA成環(huán)位點(diǎn)信息，研究人員重構(gòu)了具有反向剪接特征的環(huán)形RNA參考序列，簡(jiǎn)化了復(fù)雜的反向剪接位點(diǎn)比對(duì)問(wèn)題，并結(jié)合測(cè)序讀段比對(duì)到參考基因組和環(huán)形序列的結(jié)果，篩選出了高置信度的來(lái)自環(huán)形RNA的讀段，解決了目前環(huán)形RNA識(shí)別和定量方法中準(zhǔn)確度低和假陽(yáng)性率高的問(wèn)題。作者在模擬數(shù)據(jù)和真實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，對(duì)多種常用環(huán)形RNA識(shí)別軟件的表現(xiàn)進(jìn)行了綜合評(píng)估，發(fā)現(xiàn)該研究中開(kāi)發(fā)的方法在環(huán)形RNA表達(dá)量和成環(huán)比例的計(jì)算中，均取得了最佳的結(jié)果。

1.2. 分析流程

??將下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除接頭及各類低質(zhì)量序列。隨后借助于CIRIquant，使用Hisat2與參考基因組比對(duì)，Stringtie進(jìn)行基因水平定量；同時(shí)使用bwa-men與參考基因組比對(duì)，進(jìn)行circRNA的鑒定，構(gòu)建circRNA參考序列；將構(gòu)建的circRNA序列作為參考基因組使用Hisat2再次進(jìn)行比對(duì)，篩選出高置信度的來(lái)自環(huán)形RNA的reads；統(tǒng)計(jì)circRNA的表達(dá)情況，并注釋circRNA信息。通過(guò)對(duì)circRNA差異分析，篩選出具有顯著差異的circRNA所對(duì)相應(yīng)的基因進(jìn)行后續(xù)富集分析。 circRNA信息分析簡(jiǎn)易流程如下所示。

2. 分析結(jié)果

2.1. 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

??對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。測(cè)序數(shù)據(jù)一般為雙端測(cè)序，因此，每個(gè)測(cè)序樣本會(huì)有兩個(gè)測(cè)序結(jié)果。

評(píng)估的具體內(nèi)容：

2.2. CIRIquant分析

2.2.1. CIRIquant分析結(jié)果文件

1 . 比對(duì)結(jié)果文件：

以上結(jié)果位于文件夾：result/02.CIRIquant/1.mapping/

2 . CIRIquant鑒定結(jié)果文件：

以上結(jié)果位于文件夾：result/02.CIRIquant/2.circRNA_detection/

3 . CIRIquant鑒定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)結(jié)果文件：

以上結(jié)果位于文件夾：result/03.circRNA_info

以上統(tǒng)計(jì)圖的可視化文件：result/03.circRNA_info/view.html

表頭說(shuō)明： （result/03.circRNA_info/1.circRNA_annotation/*csv 鑒定的circRNA的注釋信息表）

2.2.2. 參考基因組比對(duì)

??測(cè)序片段（fragments）是隨機(jī)打斷的，為了確定這些一段由哪些基因轉(zhuǎn)錄來(lái)，需要將質(zhì)控后的clean reads比對(duì)到參考基因組上。使用HISAT2軟件將Clean Reads與參考基因組進(jìn)行快速精確的比對(duì)，獲取Reads在參考基因組上的定位信息[4]。HISAT2軟件官方手冊(cè)。

??如果參考基因組組裝的較為完善，而且所測(cè)物種與參考基因組一致，且相關(guān)實(shí)驗(yàn)不存在污染，那么實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的測(cè)序reads成功比對(duì)到基因組的比例會(huì)高于70% (Total Mapped Reads or Fragments)。本項(xiàng)目所用參考基因組為 hg38。

2.2.3. circRNA 預(yù)測(cè)及鑒定

?? 使用CIRIquant鑒定 circRNA ，并預(yù)測(cè) circRNA 的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)的circRNAs主要來(lái)源于基因外顯子exon，但還有其他類型，比如來(lái)源于內(nèi)含子intron、基因間intergenic、反義鏈antisense。為了更進(jìn)一步了解鑒定得到的circRNA詳細(xì)信息，隨后進(jìn)行circRNA類型，circRNA 的長(zhǎng)度分布，circRNA 的染色體分布分別進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)分析圖如下。

result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/DYQ-HCT116-input.png	result/03.circRNA_info/2.circRNA_length/DYQ-HCT116-target.png
result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/DYQ-HCT116-input.png	result/03.circRNA_info/3.circRNA_karyotype/DYQ-HCT116-target.png
result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/DYQ-HCT116-input_barplot.png	result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/DYQ-HCT116-target_barplot.png
result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/DYQ-HCT116-input_pie.png	result/03.circRNA_info/4.circRNA_type/DYQ-HCT116-target_pie.png

2.3. circRNA 差異分析

??對(duì)于無(wú)重復(fù)樣本，使用CIRIquant的CIRI_DE工具鑒定差異表達(dá)的circRNA。輸出的 DE_score 綜合了倍數(shù)變化和p值，從而提供了一種有效的方法來(lái)對(duì)差異表達(dá)的circRNA排名。此處我們篩選 |DE_score| > 1 作為顯著差異表達(dá)結(jié)果。

2.3.1. 差異分析結(jié)果文件

以上結(jié)果位于文件夾：result/04.DE/

表頭說(shuō)明： （result/04.DE/targetVSinput_deg*.xls差異分析結(jié)果文件）

2.3.2. 差異circRNA的基因組可視化

??可將比對(duì)結(jié)果bw文件、CIRIquant鑒定得到的circRNA的bed文件、以及差異circRNA分析結(jié)果同時(shí)放入IGV查看，如：

2.4. 差異circRNA宿主基因富集分析

??我們將差異circRNA的宿主基因，挑選出僅為 protein coding 的基因，用這些基因進(jìn)行后續(xù)富集分析。

??我們根據(jù)基因表達(dá)量分析得到差異基因之后，必須進(jìn)一步落到基因的功能上來(lái)。對(duì)于差異分析而言，往往涉及到成千上萬(wàn)個(gè)基因，這會(huì)使分析變得很復(fù)雜。解決思路是將一個(gè)基因列表分成多個(gè)部分，從而減少分析的復(fù)雜度。為了解決怎么分成不同類，通常會(huì)對(duì)基因功能進(jìn)行富集分析, 期望發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的生物通路, 從而揭示和理解生物學(xué)過(guò)程的基本分子機(jī)制。功能富集分析可以將成百上千個(gè)基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以減少分析的復(fù)雜度。另外，在兩種不同實(shí)驗(yàn)條件下，激活的通路顯然比簡(jiǎn)單的基因或蛋白列表更有說(shuō)服力?；蚬δ芨患治鍪紫纫獦?gòu)建基因集（ gene set，如 GO 和 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)等），也就是基因組注釋信息進(jìn)行分類。然后再把我們的目標(biāo)基因集（差異基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意區(qū)分注釋與富集。

??我們采用 clusterProfiler 軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行 GO 功能富集分析， KEGG 通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得差異基因并注釋到 GO 或 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集，背景基因集為所有進(jìn)行差異顯著分析的基因并注釋到 GO 或 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集。富集分析結(jié)果是對(duì)每個(gè)差異比較組合的所有差異基因集、上調(diào)差異基因集、下調(diào)差異基因集進(jìn)行富集。本報(bào)告中展示的表格是選取某一個(gè)比較組合的富集分析結(jié)果，圖片是部分富集分析結(jié)果。

圖 5 基因富集分析原理圖

2.4.1. 富集分析結(jié)果文件

以上結(jié)果位于文件夾：result/05.Enrichment/

網(wǎng)頁(yè)預(yù)覽圖：

• result/05.Enrichment/ALL-pdf.html

• result/05.Enrichment/DOWN-pdf.html

• result/05.Enrichment/UP-pdf.html

表頭說(shuō)明： （result/05.Enrichment/*/gene.ego_*.csv GO富集結(jié)果列表）