技術服務描述

轉錄組測序及分析報告

生信部

2021年03月19日

項目信息

合同編號：xx-xx-202x-xx-xx

客戶姓名：xxx

客戶單位：xxxxxx

1. 分析流程

1.1. 建庫測序流程

??從RNA樣品提取到最終數(shù)據(jù)獲得，樣品檢測、建庫、測序等每一環(huán)節(jié)都會直接影響數(shù)據(jù)的數(shù)量和質量，從而影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析的結果。為從源頭保證測序數(shù)據(jù)準確可靠，在數(shù)據(jù)的所有生產環(huán)節(jié)都嚴格把關，從根源上確保高質量數(shù)據(jù)的產出。建庫測序的流程：

1. Total RNA 樣本檢測

2. RNA 富集

3. 雙鏈cDNA合成

4. 末端修復、加A和接頭

5. 片段選擇和 PCR 擴增

6. 文庫質檢

7. Illumina測序

1.2. 信息分析流程

??RNA-seq的核心是基因表達差異的顯著性分析，使用統(tǒng)計學方法，比較兩個條件或多個條件下的基因表達差異，從中找出與條件相關的特異性基因，然后進一步分析這些特異性基因的生物學意義，分析過程包括質控、比對、定量、差異顯著性分析、功能富集等環(huán)節(jié)。信息分析流程如下圖所示：

2. 信息分析

2.1. 測序數(shù)據(jù)質量控制

對原始測序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進行質量評估。測序數(shù)據(jù)一般為雙端測序，因此，每個測序樣本會有兩個測序結果。

評估的具體內容見：

RawData-fastqc 文件鏈接： /result/qc/qc_rawdata/*.html
CleanData-fastqc 文件鏈接： /result/qc/qc_cleandata/*.html
Fastqc 格式補充說明： /result/qc/qc_Supplement.html

2.2. 參考基因組比對

??測序片段（fragments）是mRNA隨機打斷的，為了確定這些一段由哪些基因轉錄來，需要將質控后的clean reads比對到參考基因組上。使用HISAT2軟件將Clean Reads與參考基因組進行快速精確的比對，獲取Reads在參考基因組上的定位信息[4]。HISAT2軟件官方手冊。

??如果參考基因組組裝的較為完善，而且所測物種與參考基因組一致，且相關實驗不存在污染，那么實驗所產生的測序reads成功比對到基因組的比例會高于70% (Total Mapped Reads or Fragments)。本項目所用參考基因組為 hg38 ，下載鏈接：Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz，基因組結構注釋文件：Homo_sapiens.GRCh38.90.gtf.gz。

結果文件：

各個樣本的比對情況統(tǒng)計文件：/result/map_stat/*.flagstat.txt

2.3. 定量分析

2.3.1. 基因表達定量

??我們對每個樣本分別進行基因表達水平的定量分析，再合并得到所有樣本的表達矩陣，第一列為基因的ID，其余列為各樣本的原始read count值，seqname列之后為該基因注釋信息。

表格說明：

原始表達矩陣及注釋結果：result/Quant/gene_counts.xls

2.3.2. 樣本間相關性

??生物學重復通常是任何生物學實驗所必須的，目前主流期刊也基本要求生物學重復。生物學重復主要有兩個用途：一個是證明所涉及的生物學實驗操作不是偶然，而是可重復的。另一個是為了確保后續(xù)的差異基因分析得到更可靠的結果。樣品間基因表達水平相關性是檢驗實驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標。相關系數(shù)越接近1，表明樣品之間表達模式的相似度越高。Encode計劃建議皮爾遜相關系數(shù)的平方(R2)大于0.92(理想的取樣和實驗條件下)。具體的項目操作中，我們要求生物學重復樣品間R2至少要大于0.8，否則需要對樣品做出合適的解釋，或者重新進行實驗。根據(jù)各樣本所有基因的表達值計算組內及組間樣本的相關性系數(shù)，繪制成熱圖，可直觀顯示組間樣本差異及組內樣本重復情況。樣本間相關性系數(shù)越高，其表達模式越為接近，樣本相關性熱圖如下圖所示。

圖 1 樣本間相關性熱圖

圖中橫縱坐標為各樣本相關系數(shù)的平方

結果文件：

樣本間相關性熱圖結果：Quant/cor_pheatmap*

2.3.3. 主成分分析

??主成分分析（PCA）也常用來評估組間差異及組內樣本重復情況，PCA采用線性代數(shù)的計算方法，對數(shù)以萬計的基因變量進行降維及主成分提取。我們對所有樣本的基因表達值進行PCA分析，如下圖所示。理想條件下，PCA圖中，組間樣本應該分散，組內樣本應該聚在一起。

圖 2 主成分分析結果圖

圖中橫坐標為第一主成分，縱坐標為第二主成分

結果文件：

主成分分析結果：Quant/pca*

2.4. 差異分析

??基因表達定量完成后，需要對其表達數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，篩選樣本在不同狀態(tài)下表達水平顯著差異的基因。差異分析主要分為三個步驟。

• 首先對原始的readcount進行標準化（normalization），主要是對測序深度的校正。

• 然后統(tǒng)計學模型進行假設檢驗概率（pvalue）的計算

• 最后進行多重假設檢驗校正，得到FDR值（錯誤發(fā)現(xiàn)率，padj是其常見形式)[1-2]。

??針對不同的實驗情況，我們選用合適的軟件進行基因表達差異顯著性分析，具體如下表所示。

若按照以上標準篩選得到的差異基因過少（低于100），很有可能導致后面的功能富集分析沒有顯著性結果，所以，我們會根據(jù)項目的具體情況，適當?shù)亟档秃Y選差異基因的閾值標準。若項目實驗只關注某幾個基因的表達情況（如基因敲除），不在意富集結果，從下面的差異分析表格中篩選關注的那幾個基因即可。

??一般來說，如果一個基因在兩組樣品中的表達量差異達到兩倍以上，我們認為這樣的基因是具有表達差異的。為了判斷兩個樣品之間的表達量差異究竟是由于各種誤差導致的還是本質差異，我們需要對所有基因在這兩個樣本中的表達量數(shù)據(jù)進行假設檢驗。而轉錄組分析是針對成千上萬個基因進行的，這樣會導致假陽性的累積，基因數(shù)目越多，假設檢驗的假陽性累積程度會越高，所以引入padj對假設檢驗的P-value進行校正，從而控制假陽性的比例[3]。

??差異基因的篩選標準是非常重要的，我們給出的標準|log2(FoldChange)| > 1 & padj< 0.05是常用的經驗值，在實際項目中可以根據(jù)情況靈活選擇。例如，差異倍數(shù)可以選擇1.5倍，也可以選擇3倍，padj常用的閾值包括0.01、0.05、0.1等。若按照以上標準篩選得到的差異基因過少，很有可能導致后?的功能富集分析沒有顯著性結果。若項目實驗只關注某幾個基因的表達情況（如基因敲除），不在意富集結果，從下面的差異分析表格中篩選關注的那幾個基因即可。反之，如果得到的差異基因數(shù)目過多，不利于后續(xù)目標基因的篩選，這個時候可使用更嚴格的閾值標準進行篩選，則可以使用更嚴格的閾值標準進行篩選。

2.4.1. 差異基因的篩選

??通過Deseq2進行差異分析，我們通常采用 |log2FC|>1 & padj < 0.05 進行差異基因的篩選，隨后對差異基因進行注釋，得到包含注釋信息的差異基因列表。

結果文件：

差異基因列表及相關注釋信息（篩選結果）：result/Enrichment/Allgene_anno.xls
差異基因列表及相關注釋信息（總的結果）：result/Enrichment/Allgene_anno_ALL.xls

Differential/Allgene_anno*.xls表頭

2.4.2. 差異基因的熱圖聚類

??將所有比較組的差異基因取并集之后作為差異基因集。兩組以上的實驗，可對差異基因集進行聚類分析，將表達模式相近的基因聚在一起。我們采用主流的層次聚類對基因的表達值進行聚類分析，對行（row）進行均一化處理（Z-score）。熱圖中表達模式相近的基因或樣本會被聚集在一起，每個方格中的顏色反映的不是基因表達值，而是表達數(shù)據(jù)的行進行均一化處理后得到的數(shù)值（一般在-1到1之間），所以熱圖中的顏色只能橫向比較（同一基因在不同樣本中的表達情況），不能縱向比較（同一樣本不同基因的表達情況）。結果文件中既有組間的聚類，也有樣品間的聚類。結題報告展示了樣品間的聚類，具體如下圖所示。

圖 3 差異表達基因聚類熱圖

圖中橫坐標為樣品名，縱坐標為差異基因歸一化后的數(shù)值，顏色越紅，表達量越高，越藍，表達量越低。

結果文件：

差異基因的熱圖結果：Differential/heatmap/

2.4.3. 差異基因的火山圖分布

??火山圖可直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，如下圖所示。圖中橫坐標表示基因在處理和對照兩組中的表達倍數(shù)變化(log2FoldChange)，縱坐標表示基因在處理和對照兩組中表達差異的顯著性水平(-log10padj或-log10pvalue)。為上調基因用紅色點表示，下調基因用藍色點表示。

圖 4 差異基因火山圖

圖中橫坐標為log2FoldChange值，縱坐標為-log10padj或-log10pvalue，藍色的虛線表示差異基因篩選標準的閾值線

結果文件：

差異基因的火山圖結果：Differential/volcano/volcano.png

2.5. 富集分析

??我們根據(jù)基因表達量分析得到差異基因之后，必須進一步落到基因的功能上來。對于轉錄組分析而言，往往涉及到成千上萬個基因，這會使分析變得很復雜。解決思路是將一個基因列表分成多個部分，從而減少分析的復雜度。為了解決怎么分成不同類，通常會對基因功能進行富集分析, 期望發(fā)現(xiàn)在生物學過程中起關鍵作用的生物通路, 從而揭示和理解生物學過程的基本分子機制。功能富集分析可以將成百上千個基因、蛋白或者其他分子分到不同的通路中，以減少分析的復雜度。另外，在兩種不同實驗條件下，激活的通路顯然比簡單的基因或蛋白列表更有說服力?；蚬δ芨患治鍪紫纫獦嫿ɑ蚣?span style="font-family:Times New Roman;box-sizing: border-box;">gene set，如GO和KEGG數(shù)據(jù)庫等），也就是基因組注釋信息進行分類。然后再把我們的目標基因集（差異基因集或者其他基因集）映射到背景基因集上，注意區(qū)分注釋與富集。

??我們采用clusterProfiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得差異基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集，背景基因集為所有進行差異顯著分析的基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫的基因集。富集分析結果是對每個差異比較組合的所有差異基因集、上調差異基因集、下調差異基因集進行富集。本報告中展示的表格是選取某一個比較組合的富集分析結果，圖片是所有組合的富集分析結果。

圖 5 基因富集分析原理圖

2.5.1. 富集分析結果文件

• all 分析結果文件夾：result/Enrichment/all/

• up 分析結果文件夾：result/Enrichment/up/

• down 分析結果文件夾：result/Enrichment/down/

• all 網(wǎng)頁預覽圖：result/Enrichment/all-pdf.html

• up 網(wǎng)頁預覽圖：result/Enrichment/up-pdf.html

• down 網(wǎng)頁預覽圖：result/Enrichment/down-pdf.html

說明：

• all/up/down分別對應總差異基因，上調差異基因，下調差異基因進行對應的富集分析。

表頭說明： （Results/*enrich_*/gene.ego_*.csv GO富集結果列表）

表頭說明： （Results/*enrich_*/gene.KEGG*.csv KEGG富集結果列表）

2.5.2. GO功能富集分析

??GO(Gene Ontology)是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，可分為生物過程（biological process）和細胞組成（cellular component）分子功能（Molecular Function）三個部分。GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著性富集的閾值，富集結果見結果文件。

??從GO富集分析結果中，選取最顯著的30個Term繪制柱狀圖進行展示，若不足30個，則繪制所有Term，按生物過程、細胞組分和分子功能三大類別及差異基因上下調分類畫的柱狀圖。

??有向無環(huán)圖(Directed Acyclic Graph，DAG)為差異基因GO富集分析結果的圖形化展示方式。圖中，分支代表包含關系，從上至下所定義的功能范圍越來越小，選取每個差異比較組合的GO富集結果最顯著性前5位的GO Term作為有向無環(huán)圖的主節(jié)點，并通過包含關系，將相關聯(lián)的GO Term一起展示，顏色的深淺代表富集程度。我們的項目中分別繪制生物過程、分子功能和細胞組分的DAG圖。

圖 6 GO富集分析柱狀圖

圖中縱坐標為GO Term，橫坐標為GO Term富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著

圖 7 GO富集分析散點圖

圖中橫坐標為注釋到GO Term上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為GO Term

圖 8 GO富集分析DAG圖

每個節(jié)點代表一個GO術語，方框代表的是富集程度為TOP5的GO，顏色的深淺代表富集程度，顏色越深就表示富集程度越高，每個節(jié)點上展示了該TERM的名稱及富集分析的padj

2.5.3. KEGG通路富集分析

??KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。KEGG通路富集以padj小于0.05作為顯著性富集的閾值，富集結果見結果文件。

??從KEGG富集結果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制柱狀圖進行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標為KEGG通路。

??從KEGG富集結果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖進行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為KEGG通路，點的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。

圖 9 KEGG富集分析柱狀圖

圖中橫坐標為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，縱坐標為KEGG通路。

圖 10 KEGG富集散點圖

圖中橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標為KEGG通路