技術(shù)服務(wù)描述

染色質(zhì)免疫共沉淀測序 RIP-Seq 結(jié)題報告

生信部

2020年08月25日

項(xiàng)目信息

合同編號：XXX-2020-01-01-01

客戶姓名：XXX

客戶單位：X X X X X X

1. 工作流程

RNA免疫共沉淀（RIP）是一種用于研究蛋白質(zhì)與 RNA 的體內(nèi)相互作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)技術(shù)。采用特異性抗體將目的蛋白進(jìn)行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所結(jié)合的RNA片段也富集下來。通過與高通量測序技術(shù)的結(jié)合，對 RIP 后的RNA 產(chǎn)物進(jìn)行測序分析， 從全基因組范圍內(nèi)尋找目的蛋白的 RNA 結(jié)合位點(diǎn)，以高效率的測序手段得到高通量的數(shù)據(jù)結(jié)果。

1.1. RIP 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)流程

目前主要有兩種不同的RIP 實(shí)驗(yàn)方法，大致流程如下（以細(xì)胞樣品的處理過程為例）：

RNA Immunoprecipitation

1. 準(zhǔn)備足量的新鮮細(xì)胞，每個IP約1x107個細(xì)胞，用RIP裂解液裂解細(xì)胞

2. 加入2-5ug抗體，抗體與蛋白，4℃孵育過夜

3. 加入proteinA/G磁珠，4℃孵育4-6小時

4. 清洗磁珠。

5. Proteinase K 解交連。

6. 酚氯仿或RNA提取試劑盒提取RNA

7. QPCR 檢測或建庫測序

1.2. RIP Sequencing 文庫構(gòu)建流程

1. 用qubit 及2100對RIP片段進(jìn)行定量及片段長度檢測

2. 加入適當(dāng)?shù)腗g2+,加熱打斷RNA片段

3. 加入反轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄成cDNA

4. 斷裂RNA鏈且以斷裂RNA為引物，cDNA為模版，形成雙鏈DNA

5. 補(bǔ)齊片段末端，并在3’末端加A尾

6. 添加Adapter

7. 0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter

8. 文庫PCR擴(kuò)增

9. 1XAMPure beads 去掉多余的primer

10. qPCR測定文庫濃度

11. Agilent 2100測定文庫片段大小

1.3. 生物信息分析流程

將測序結(jié)果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)信息分析及個性化分析。信息分析流程如下：

2. 生物信息分析

2.1. RIP Sequencing 文庫質(zhì)檢結(jié)果

文庫片段質(zhì)檢，RIP文庫的染色質(zhì)片段在150-300bp之間，建庫加入約140bp的接頭后，片段應(yīng)該分布在300-450bp之間為最好。

2.2. 下機(jī)數(shù)據(jù)結(jié)果

2.3. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

對原始測序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估。RIP數(shù)據(jù)一般為雙端測序，因此，每個測序樣本會有兩個測序結(jié)果。

評估的具體內(nèi)容見：

RawData-fastqc 文件鏈接： /result/01.qc/qc_rawdata/*.html
CleanData-fastqc 文件鏈接： /result/01.qc/qc_cleandata/*.html
Fastqc 格式補(bǔ)充說明： /result/01.qc/qc_Supplement.html

2.4. Peak calling數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

質(zhì)檢后的reads，采用trim-galory對reads進(jìn)行去接頭，去接頭后，再次對reads進(jìn)行質(zhì)檢，主要檢測接頭是否去除干凈。去除接頭的reads，用hisat2軟件將reads mapping到基因組上，得到reads在基因組上的信息，即.bam文件，將input的.bam文件與IP的.bam文件，通過MASC2進(jìn)行 peak calling，得到peak文件，即為.bed文件，對得到的peak進(jìn)行注釋，并進(jìn)行功能分析。

采用常用 reads 富集峰鑒定軟件 MACS2 在全基因范圍進(jìn)行 peak 掃描，得到 Peak 在基因組上的位置信息、peak 富集信息等。

圖 2.4.1 全基因組 Reads 富集峰

使用Chipseeker對Reads富集峰進(jìn)行注釋，得到tss上下游3k的基因注釋信息。使用bedtools對富集峰與protein coding取交集得到所在基因，對其進(jìn)行后續(xù)富集分析。

圖 2.4.2 Peak信息anno流程圖

結(jié)果文件見：

reads在基因組上的分布信息： /result/02.callPeak/WGY-target.bw

callPeak peak信息：/result/02.callPeak/WGY-target_peaks.bed

callPeak tss上下游3k注釋信息： /result/02.callPeak/WGY-target.peakanno.csv

callPeak 與 protein coding 交集基因信息： /result/02.callPeak/WGY-target_peaks.tsv

callPeak 與 protein coding 交集基因注釋信息： /result/02.callPeak/gene.list.annoinfo.xls

2.5. Peak 基因注釋與 GO 功能分析

Peak 所在基因進(jìn)行GO 功能分析，并按照基因功能進(jìn)行聚類分析。y軸為基因的功能聚類，x軸為基因count數(shù)，顏色為校正p值。GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著性富集的閾值，GO分析有3種類型，分別為CC(細(xì)胞組分），MF(分子功能），BP(生物過程）。富集結(jié)果見：

條形圖縱坐標(biāo)為GO Term，縱坐標(biāo)為count數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小。

圖 2.5.1 Peak 相關(guān)基因的GO 功能富集分析（條形圖）

氣泡圖縱坐標(biāo)為GO Term，點(diǎn)的大小代表注釋到GO Term上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小

圖 2.5.2 Peak 相關(guān)基因的 GO 功能富集分析（氣泡圖）

結(jié)果文件見：

/result/03.Enrichment/go/*

2.6. Peak 基因注釋與 KEGG通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫。KEGG通路富集以padj小于0.05作為顯著性富集的閾值，富集結(jié)果如下表所示，見結(jié)果文件：Enrichment/KEGG。 ?從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足20個，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標(biāo)為KEGG通路，縱坐標(biāo)為通路富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著。

圖 2.6.1 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析(條形圖）

氣泡圖縱坐標(biāo)為GO Term，點(diǎn)的大小代表注釋到GO Term上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小

圖 2.6.2 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）

結(jié)果文件：

/result/03.Enrichment/kegg/*

附 錄

關(guān)于賽誠生物

廣州賽誠生物科技有限公司是一家專注于科研基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)服務(wù)及基因測序相關(guān)服務(wù)的生物技術(shù)公司。公司已有成熟的ChIP-seq，RNA-seq，甲基化及各種文庫構(gòu)建服務(wù)流程，具有豐富的文庫構(gòu)建和測序分析經(jīng)驗(yàn)。同時，公司也開發(fā)多項(xiàng)前沿的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，現(xiàn)已形成完善的ATAC-seq，CUT&TAG-seq體系。

除此之外，在基礎(chǔ)科研服務(wù)方面，我們也有巨大優(yōu)勢。傳統(tǒng)優(yōu)勢服務(wù)包括RNA pull down，DNA pull down，RIP，co-IP，細(xì)胞功能，流式檢測，F(xiàn)ISH等。最近剛剛興起的ChIRP實(shí)驗(yàn)已成為我們的主流產(chǎn)品，他可以同時檢測DNA、RNA、蛋白三者互作。

因此，我么擁有一支專注以“表觀組學(xué)”為核心的醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)，團(tuán)隊(duì)豐富的的科研經(jīng)驗(yàn)涵蓋了表觀基因組學(xué)和基因組學(xué)中的各個方面，對多個組學(xué)的數(shù)據(jù)分析和挖掘有著豐富的 經(jīng)驗(yàn)和全面的理解，比如：基因組修飾、染色質(zhì)調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控、基因組變異等，我們 致力于提供領(lǐng)先的個性化的表觀組學(xué)為核心的多組學(xué)整體解決方案。

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