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項目名稱：染色質(zhì)免疫共沉淀測序 ChIP-Seq 結(jié)題報告
所屬分類：生物信息學分析-報告解讀
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技術(shù)服務描述
染色質(zhì)免疫共沉淀測序 ChIP-Seq 結(jié)題報告
生信部
2020年08月25日
項目信息
合同編號：XXX-2020-01-01-01
客戶姓名：XXX
客戶單位：X X X X X X
1. 工作流程
染色體免疫共沉淀（ChIP）是一種用于研究蛋白質(zhì)與 DNA 的體內(nèi)相互作用的經(jīng)典實驗技術(shù)。采用特異性抗體將目的蛋白進行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所結(jié)合的基因組 DNA 片段也富集下來。通過與高通量測序技術(shù)的結(jié)合，對 ChIP 后的DNA 產(chǎn)物進行測序分析， 從全基因組范圍內(nèi)尋找目的蛋白的 DNA 結(jié)合位點，以高效率的測序手段得到高通量的數(shù)據(jù)結(jié)果。
1.1. ChIP 免疫沉淀實驗流程
目前主要有兩種不同的ChIP 實驗方法，大致流程如下（以細胞樣品的處理過程為例）：
Cross-liking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP)
準備足量的新鮮細胞，每個IP約4x106個細胞，用新鮮的1%的甲醛處理細胞，進行細胞交聯(lián)。
125mM的甘氨酸終止交聯(lián)，收集細胞。
超聲或酶解打斷染色質(zhì)，將基因組 DNA 打斷至 100-500bp。
將抗體（一般為1～5ug）與染色質(zhì)片段4℃孵育過夜。
加入proteinA/G beads進行4℃孵育4-6小時。
Proteinase K 解交連。
酚氯仿或DNA提取試劑盒提取DNA
QPCR 檢測或建庫測序
1.2. ChIP Sequencing 文庫構(gòu)建流程
用qubit 對ChIP片段進行定量檢測
補齊片段末端，并在3’末端加A尾
添加Adapter
0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter
文庫PCR擴增
1XAMPure beads 去掉多余的primer
qPCR測定文庫濃度
Agilent 2100測定文庫片段大小
1.3. 生物信息分析流程
將測序結(jié)果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續(xù)標準信息分析及個性化分析。信息分析流程如下：
2. 數(shù)據(jù)結(jié)果及生物信息分析
2.1. ChIP Sequencing 文庫質(zhì)檢結(jié)果
文庫片段質(zhì)檢，ChIP文庫的染色質(zhì)片段在100-500bp之間，建庫加入約140bp的接頭后，片段應該分布在250-700bp之間為最好。
Fragment Analyzer （FA）毛細管電泳檢測：
檢測結(jié)果匯總：（以下結(jié)果中文庫大小為 FA 判定結(jié)果）
2.2. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制
對原始測序數(shù)據(jù)及去除接頭后的可用數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估。
具體的qc報告見：
2.3. Reads 在全基因組的可視化分布
使用 IGV 軟件對 Reads 進行可視化查看，可以查看全基因組任何感興趣位置的 reads 富集情況，示例如下：
IGV 的安裝使用參考：http://software.broadinstitute.org/software/igv/
可視化操作步驟依次是：
在軟件的 Genome 選項，基因參考序列 hg38 ；
在軟件的 File 選項，上傳 要查看染色體 bigwig 文件；
以上文件上傳后可查看該染色體任意位置的基因信息及 reads 富集情況。
結(jié)果文件 ：
2.4. 全基因組 Reads 富集峰 Peak 鑒定
采用常用 reads 富集峰鑒定軟件 MACS 在全基因范圍進行 peak 掃描，得到 Peak 在基因組上的位置信息、peak 富集信息等。
圖1 全基因組 Reads 富集峰
結(jié)果文件：
Results/JFY.peakanno.csv
Results/2.4.peak_scan/JFY.covplot.pdf
2.5. Reads 在 TSS 近端富集強度分析
TSS 轉(zhuǎn)錄起始位點近端（0-3kb）與特定的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有關，統(tǒng)計 reads 在TSS 近端的分布情況。
圖 2 reads 在 TSS 近端富集強度的分布（熱圖分布）
圖 3 reads 在 TSS 近端富集強度的分布（峰圖分布）
結(jié)果文件：
Results/2.5.tss_near/JFY.tagheatmap.pdf
Results/2.5.tss_near/JFY.plotavgprof.pdf
2.6. Reads 在 TSS 近端及遠端富集強度分析
TSS 轉(zhuǎn)錄起始位點近端（0-3kb）及遠端（10kb以上）的 reads 分布與特定的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有關，統(tǒng)計 reads 在TSS 近端及遠端的分布情況。
圖4 reads 在 TSS 近端及遠端富集強度的分布
結(jié)果文件：
2.7. Peak 在基因組上的分布
將 Peak 根據(jù)位置信息進行基因組注釋基因結(jié)構(gòu)元件，分別統(tǒng)計 Peak 在結(jié)構(gòu)元件（intergenic region、upstream 5K、5`UTR、exon、intron，3’UTR、downstream5k）的數(shù)目，并根據(jù)其在各個元件上的富集程度，繪制分布特征。
Peak 在基因結(jié)構(gòu)元件上的分布特征：
圖5 Peak 在基因結(jié)構(gòu)元件上的分布
圖6 Peak 在基因結(jié)構(gòu)元件上的分布比例
Peak 在各基因結(jié)構(gòu)元件上的交叉分布特征：
圖7 Peak 在基因結(jié)構(gòu)元件上的交叉分布（upsetplot）
圖8 Peak 在基因結(jié)構(gòu)元件上的交叉分布（vennpie）
結(jié)果文件：
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnobar.pdf
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnopie.pdf
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnoupset.pdf
Results/2.7.peak_dis/JFY.peakAnnovinnpie.pdf
2.8. Peak 基因注釋與 GO 功能分析
將 Peak 注釋到基因promoter區(qū)，并對 Peak 相關基因進行GO 功能分析，并按照基因功能進行聚類分析。y軸為基因的功能聚類，x軸為基因count數(shù)，顏色為校正p值。
圖9 Peak 相關基因的GO 功能富集分析（條形圖）
圖10 Peak 相關基因的 GO 功能富集分析（氣泡圖）
結(jié)果文件：
Results/2.8.go/JFY.ego_ALL.csv
Results/2.8.go/JFY.GO-barplot.pdf
Results/2.8.go/JFY.GO-dotplot.pdf
2.9. Peak 基因注釋與 KEGG 通路分析
將 Peak 注釋到基因promoter，并對 Peak 相關基因進行GO 功能分析，并按照基因功能進行聚類分析。y軸為基因的功能聚類，氣泡大小為基因count數(shù)，顏色為校正p值。
Pathway1中對peaks進行基因注釋，僅采用臨近基因注釋。
Pathway2中對peaks進行基因注釋，需要考慮多個因素，包括注釋基因的外顯子/內(nèi)含子，promoter區(qū)，也包括peaks兩側(cè)可能包含順式調(diào)控元件的區(qū)域。
Pathway1:
圖11 Peak 相關基因的KEGG通路富集分析（條形圖）
圖12 Peak 相關基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）
Pathway2:
圖13 Peak 相關基因的KEGG通路富集分析（條形圖）
圖14 Peak 相關基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）
結(jié)果文件：
Results/2.9.kegg/JFY.KEGG**.csv
Results/2.9.kegg/JFY.pathway**.pdf
2.10. Peak 區(qū)域 Motif 分析
用 Tomtom 軟件對 Peak 區(qū)域鑒定 motif 序列；并將得到的 motif 序列與 JASPAR 數(shù)據(jù)庫（JASPAR CORE 2016 database）進行比對，鑒定已知的 motif。
Tomtom 結(jié)果示例：
結(jié)果文件：
Results/2.10.motif/homerResults.html
Results/2.10.motif/knownResults.html
附 錄
關于賽誠生物
廣州賽誠生物科技有限公司是一家專注于科研基礎實驗服務及基因測序相關服務的生物技術(shù)公司。公司已有成熟的ChIP-seq，RNA-seq，甲基化及各種文庫構(gòu)建服務流程，具有豐富的文庫構(gòu)建和測序分析經(jīng)驗。同時，公司也開發(fā)多項前沿的實驗技術(shù)，現(xiàn)已形成完善的ATAC-seq，CUT&TAG-seq體系。
除此之外，在基礎科研服務方面，我們也有巨大優(yōu)勢。傳統(tǒng)優(yōu)勢服務包括RNA pull down，DNA pull down，RIP，co-IP，細胞功能，流式檢測，F(xiàn)ISH等。最近剛剛興起的ChIRP實驗已成為我們的主流產(chǎn)品，他可以同時檢測DNA、RNA、蛋白三者互作。
因此，我么擁有一支專注以“表觀組學”為核心的醫(yī)學轉(zhuǎn)化技術(shù)服務團隊，團隊豐富的的科研經(jīng)驗涵蓋了表觀基因組學和基因組學中的各個方面，對多個組學的數(shù)據(jù)分析和挖掘有著豐富的 經(jīng)驗和全面的理解，比如：基因組修飾、染色質(zhì)調(diào)控、基因表達調(diào)控、基因組變異等，我們 致力于提供領先的個性化的表觀組學為核心的多組學整體解決方案。
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