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項目名稱：CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)（knock in）
所屬分類：Cas9實驗
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技術(shù)服務描述
CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)（knock in）
?實驗原理：
CRISPR-Cas9基因敲入系統(tǒng)是Cas9內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，且有一段高度同源的DNA修復模板存在的情況下，生物體內(nèi)啟動HDR修復路徑，將一段外源DNA定點插入基因內(nèi)部。
同源性定向修復（HDR）途徑，對比NHEJ修復途徑，同源性定向修復（HDR）途徑是更為精確的修復機制。 這種修復機制主要用于CRISPR Cas9系統(tǒng)介導的基因敲入。 在該修復路徑中，需要將一段與預期編輯位點上下游緊鄰序列具有高度同源性的DNA修復模板、特異的gRNA和Cas9核酸酶一起引入細胞中。 在高度同源性DNA模板存在的情況下， HDR機制可以通過同源重組將一段DNA插入編輯位點（圖4）。這種修復方式可以將一段DNA序列精準地插入特定的基因組位點。
圖1基因敲入原理圖
?實驗流程
1. 設計sgRNA-Cas9及修復DNA模版
2 .構(gòu)建sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒
3 .將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉(zhuǎn)293T細胞
4 .嘌呤篩選，檢測熒光
5 .PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入
?實驗步驟
1、設計sgRNA及修復DNA模版
針對人類AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設計了sgRNA進行軟件分析以確保sgRNA沒有預測的脫靶結(jié)合位點。設計DNA修復模版，兩側(cè)同源臂，其兩側(cè)各有600bp的同源臂。
2、 構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒
將選定的sgRNA設計與CMV啟動子驅(qū)動的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制備pCas-Guide-AAVS1（圖2）。
將DNA修復模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達載體（圖2）。
圖2 sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模版質(zhì)粒
3 、將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉(zhuǎn)293T細胞
用lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞。
4、 嘌呤篩選，檢測熒光
嘌呤篩選3-4周
3-4周后，> 95％的HEK293細胞表達RFP（圖3）。
圖3 熒光檢測圖片 A轉(zhuǎn)染篩選后明場圖片 B轉(zhuǎn)染篩選后熒光圖片 C未轉(zhuǎn)染加嘌呤篩選細胞
5 、PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入
為了證實在基因組DNA中敲入RFP，設計引物對，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因內(nèi)的引物2。1.1kb的PCR產(chǎn)物表明在AAVS1位點敲入成功; 沒有PCR擴增指示敲入不成功（圖4）。
圖4 PCR產(chǎn)物檢測，在對照細胞（'WT細胞'）中沒有看到PCR擴增
