3D基因組學(xué)：一個(gè)嶄新的領(lǐng)域

日期：2018-11-15 標(biāo)簽：3D基因組,TAD

倘若僅是回望基因組學(xué)本身的發(fā)展歷程——從1977年首個(gè)生物基因組噬菌體φX174序列被測(cè)定，到2003年人類基因組計(jì)劃完成，再到2012年ENCODE計(jì)劃完成——還不足以代表人類解讀生命遺傳奧秘的歷史。我們更應(yīng)該回顧和基因組學(xué)不分家的遺傳學(xué)之發(fā)展歷程。

高中的生物學(xué)課堂就已經(jīng)學(xué)到，Gregor Johann Mendel（孟德爾）是遺傳學(xué)的奠基人，他的“豌豆雜交實(shí)驗(yàn)”（1856-1863年），依然是中學(xué)生物考題的常用材料。隨后，對(duì)孟德爾由路轉(zhuǎn)粉的Thomas Hunt Morgan（摩爾根）利用果蠅的突變體，首次確認(rèn)基因位于染色體上，提出“連鎖互換定律”，成為了現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基人（1908-1915；摩爾根的貢獻(xiàn)非常多，這個(gè)時(shí)間段只是一個(gè)粗略的標(biāo)記）。

對(duì)如今的我們來說，不難理解DNA與RNA是攜帶遺傳信息的物質(zhì)。不過在上世紀(jì)中期以前，世人還認(rèn)為蛋白質(zhì)才是遺傳物質(zhì)。1928年，F(xiàn)rederick Griffith（格里菲斯）的“肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)”，提出了轉(zhuǎn)化因子學(xué)說。但直到1944年，Oswald Avery、Colin MacLeod和Maclyn McCarty三人通過比較蛋白質(zhì)、多糖與DNA等的轉(zhuǎn)化效應(yīng)，才逐漸樹立了DNA是遺傳物質(zhì)的地位。到了1952年，Alfred Hershey與Martha Chase利用同位素分別標(biāo)記蛋白質(zhì)和DNA，最終確認(rèn)了DNA是遺傳物質(zhì)。

早在DNA發(fā)現(xiàn)之初（1869年，F(xiàn)riedrich Miescher），科學(xué)家便展開了對(duì)其物理結(jié)構(gòu)的鑒定。但一直到1953年，才由James Watson和Francis Crick闡明了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

真核生物的基因組含有大量的結(jié)合蛋白，包括組蛋白。在原核生物中，也有組蛋白樣的DNA結(jié)合蛋白。1974-1976年間，科學(xué)家首次獲得DNA纏繞在組蛋白上的電鏡照片（Science. 1974 Jan 25;183(4122):330-2.，Exp Cell Res. 1976 Jan;97:101-10.），并最終在1997年獲得結(jié)晶結(jié)構(gòu)（Nature. 1997 Sep 18;389(6648):251-60.）。

DNA-組蛋白這種beads on a string“串珠式”的結(jié)構(gòu)，能夠顯著縮短DNA鏈在一維水平的尺度，大概7倍。形象一些，對(duì)于人類全部DNA而言，將DNA鏈線性展開，能得到約為2米的長鏈，再經(jīng)串珠式壓縮，也還有約29厘米。顯然，這對(duì)于袖珍的細(xì)胞核來說，這種結(jié)構(gòu)依然太大了。對(duì)染色體的形態(tài)觀察也提示，DNA與結(jié)合蛋白一定形成了更加高級(jí)的結(jié)構(gòu)。

2005年，Timothy J. Richmond團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了chromatin fiber（染色質(zhì)纖維）的結(jié)構(gòu)。2014年，中國科學(xué)家Ping Zhu和Guohong Li小組得到了更加精確的染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)。他們的研究都證明，DNA-組蛋白的串珠式結(jié)構(gòu)，還會(huì)進(jìn)一步被壓縮成直徑僅有30納米的纖維結(jié)構(gòu)。而在目前的理論模型中，這些染色質(zhì)纖維還會(huì)在包括Cohesin、CTCF等蛋白的幫助之下，扭曲成環(huán)，形成更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，最終被壓縮成染色體。

講了半天歷史，目的是為了讓各位讀者能夠得到這樣一個(gè)基本認(rèn)識(shí)：生命體的遺傳功能元件，包括編碼基因、非編碼基因、順式調(diào)控元件等，在空間結(jié)構(gòu)上，并不是在染色體上呈線性地一字依次排開，而是隨著DNA形成復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，具備了三維組織形式。

為了加深印象，我們不妨再來看下方另外一幅染色體結(jié)構(gòu)的卡通。簡而言之，DNA雙鏈就跟糾纏在一起的電話線一般，一圈圈地繞行、壓縮，最終形成了染色體。也正因?yàn)橛羞@種繞圈圈的壓縮方式，我們不難想象，DNA能夠密密麻麻地形成許多環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)還能再繼續(xù)繞圈壓縮下去。

換句話說，在DNA一維層面上相隔比較遠(yuǎn)的區(qū)域，反而有可能靠得更近。比方說下圖中的ABCD四個(gè)點(diǎn)，若以A為參照物，C比B遠(yuǎn)，但由于基因組形成了高級(jí)結(jié)構(gòu)，反而把A和C拉得更近。這個(gè)示意圖還提示了另外一個(gè)問題，即同一條染色體上的某些區(qū)域，可能很難互相接觸，比如B和D之間就，被環(huán)狀結(jié)構(gòu)給隔開了。

DNA這種相對(duì)穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是由蛋白質(zhì)來維持的。這同時(shí)也為破解基因組的三維結(jié)構(gòu)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。我們?cè)賮砝蒙厦婺莻€(gè)ABCD四個(gè)小點(diǎn)的圖來理解這一項(xiàng)技術(shù)。假如說，A和C是幫助DNA凹造型的蛋白，并且它們靠得很近，甚至有蛋白-蛋白相互作用。這時(shí)，我們使用甲醛等交聯(lián)劑，就可以把DNA-結(jié)合蛋白以及他們之間形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)給固定下來。但這種復(fù)合物體積非常龐大，為了方便測(cè)序建文庫，我們需要將DNA利用超聲或限制性內(nèi)切酶打碎。這時(shí)候我們得到的，就是許許多多由蛋白質(zhì)緊緊鎖住的包含缺口的小結(jié)構(gòu)。我們?cè)儆妹赴堰@些斷裂的DNA給修復(fù)回去，就會(huì)得到許多能夠發(fā)生相互作用的、具備環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA了。最后，我們?cè)偻ㄟ^測(cè)序的方法就能發(fā)現(xiàn)，原本中間隔了個(gè)B的A和C位點(diǎn)，居然靠到一起，而C和D雖然很靠近，但卻可能測(cè)不到它們?cè)谝黄稹?/p>

上面所述的方法，便是染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Chromatin Conformation Capture）技術(shù)。大致的流程，可以看下面的圖片。最早的技術(shù)路線（簡稱3C，源自英文名首字母），只能研究一個(gè)位點(diǎn)對(duì)另外一個(gè)位點(diǎn)的相互作用（一對(duì)一）。而后又發(fā)展出了4C（一對(duì)全），5C（多對(duì)多），Hi-C（全對(duì)全），Capture-C（多重一對(duì)一）等技術(shù)。只是隨著復(fù)雜度的提高，分辨率也會(huì)降低。相關(guān)綜述可以看這篇文章Unraveling the 3D genome: genomics tools for multi-scale exploration，這里就不詳述了。

通過構(gòu)象捕獲技術(shù)，從全基因組的角度而言，科學(xué)家都得到了什么樣的發(fā)現(xiàn)呢？

許多小組都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共同現(xiàn)象：如下圖所示，基因組的相互作用，因其三維的物理結(jié)構(gòu)，形成了許多分區(qū)。為了讀懂這個(gè)圖，我們需要先理解它是如何繪制。假設(shè)線性的染色體座位的藍(lán)、橙、綠三點(diǎn)之間能夠發(fā)生相互作用，我們就用線段把它們連起來，形成一個(gè)等腰三角形，并在線段的交叉點(diǎn)，用顏色的深淺，來代表相互作用的頻率，或者說強(qiáng)度。

通過這種方法作圖，可以得到許多三角形結(jié)構(gòu)，密集排布在染色體之上。有些小的三角形，顏色比較深，代表著這個(gè)三角形內(nèi)部的相互作用更頻繁，同時(shí)它們之間甚至有些“涇渭分明”地相鄰排布，即甚少與相鄰區(qū)域發(fā)生相互作用，從而形成不同的結(jié)構(gòu)域。科學(xué)家將這樣的結(jié)構(gòu)域稱為Topologically Associating Domain（TAD，中文名姑且翻譯為“拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域”）。但又不是說，小結(jié)構(gòu)域之間就絕對(duì)不會(huì)發(fā)生相互作用了，只是頻率會(huì)比較低。數(shù)個(gè)相鄰且又能發(fā)生相互作用的TAD，就形成了Superdomain（超結(jié)構(gòu)域）。隨著在染色體上的物理距離增大，相互作用的頻率會(huì)呈負(fù)指數(shù)式降低。

TAD里面會(huì)是些什么東西呢？

在哺乳動(dòng)物基因組中，TAD通常由CTCF這個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子給分割開來。CTCF還會(huì)和Cohesin蛋白復(fù)合物結(jié)合，幫助基因組形成相對(duì)穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。正由于此，兩個(gè)TAD之間的轉(zhuǎn)錄活性是非常低的（轉(zhuǎn)錄需要打開DNA），而結(jié)合CTCF等轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA元件，也被稱為insulator（絕緣子）。

不過，在TAD內(nèi)部可就熱鬧了。CTCF在幫助基因組DNA凹造型的同時(shí)，就把線性展開時(shí)距離較遠(yuǎn)的DNA元件給綁到了一起。而這樣相互作用的元件，通常是enhancer（增強(qiáng)子）和promoter（啟動(dòng)子）。

這樣做有兩個(gè)好處。一是縮短了enhancer和promoter之間的空間距離，增強(qiáng)了基因的轉(zhuǎn)錄。二是給調(diào)控元件合理分區(qū)，使得基因轉(zhuǎn)錄在不同發(fā)育階段、不同生理?xiàng)l件下，受到特定enhancer的調(diào)控。比方說，在胚胎發(fā)育早期，干細(xì)胞那套基因的表達(dá)會(huì)占主導(dǎo)。隨著發(fā)育的進(jìn)行，表達(dá)模式會(huì)逐漸替換成特定lineage的基因，再到成熟細(xì)胞的基因。倘若沒有這樣的動(dòng)態(tài)調(diào)整的三維分區(qū)，這種基因的空間與時(shí)序性表達(dá)機(jī)制，估計(jì)就很難實(shí)現(xiàn)了。

當(dāng)然，這里并不是在表達(dá)一種設(shè)計(jì)論的觀點(diǎn)。這種精致的調(diào)控機(jī)制，是在漫長的進(jìn)化過程中，逐漸選擇、適應(yīng)的結(jié)果。

TAD除了形成相對(duì)穩(wěn)定的遺傳信息表達(dá)功能結(jié)構(gòu)之外，還有其他重要的生物學(xué)意義。比如它同樣也是細(xì)胞周期S期時(shí)，DNA復(fù)制的結(jié)構(gòu)單元。在不久的將來，科學(xué)家還將發(fā)現(xiàn)更多的三維基因組功能。

讀到這里，我想各位讀者應(yīng)該不難理解，假設(shè)基因組的三維結(jié)構(gòu)出了差錯(cuò)，后果可是相當(dāng)嚴(yán)重。這里本司機(jī)舉兩個(gè)例子來說明。

首先，維系正常的基因組三維結(jié)構(gòu)，對(duì)保持正常的發(fā)育進(jìn)程有重要的意義。早有文獻(xiàn)通過經(jīng)典的遺傳學(xué)方法，將F syndrome（表現(xiàn)為手指、腳趾、腭和胸骨發(fā)育異常）這種遺傳疾病定位到了染色體2q36處。這個(gè)區(qū)域含有對(duì)發(fā)育具有重要意義的IHH、WNT6A、WNT10A、PAX3和STK36等基因。如下圖所示，最近的研究證明，在有些F syndrome的病例中，WNT6A基因所在的TAD邊界染色體區(qū)域發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，使得相鄰TAD的增強(qiáng)子跑到WNT6A所在的TAD之中，導(dǎo)致WNT6A異常表達(dá)。在小鼠模型中，用CRISPR敲除PAX3基因所在TAD的邊界，同樣會(huì)導(dǎo)致相鄰TAD的增強(qiáng)子跑過來調(diào)控PAX3，使其表達(dá)量異常升高，造成小鼠指骨發(fā)育異常。與此對(duì)照，用CRISPR敲除相鄰TAD內(nèi)部的序列，不碰及PAX3所在TAD的邊緣，PAX3基因的表達(dá)水平就不會(huì)異常升高，也不會(huì)有發(fā)育異?，F(xiàn)象

第二個(gè)例子來自于癌癥。腫瘤細(xì)胞的基因組是非?；靵y的，有許多擴(kuò)增、缺失和易位。拿原癌基因?yàn)槔?，它的高表達(dá)可以來自于原癌基因本身的拷貝數(shù)增加，也可以是其表達(dá)調(diào)控機(jī)制得到了增強(qiáng)。這篇綜述（Copy number alterations unmasked as enhancer hijackers.）為我們?cè)斀猓蔷幋a區(qū)域拷貝數(shù)的異常，是如何導(dǎo)致原癌基因的過度表達(dá)的。比如說，MYC基因座位的易位，導(dǎo)致它跑到一個(gè)IGH增強(qiáng)子附近（a）。MYB基因附近的染色體區(qū)域缺失，把遠(yuǎn)處的QKI增強(qiáng)子給帶到它身邊（b）。TAL1所在TAD邊緣的染色體區(qū)域缺失，導(dǎo)致相鄰增強(qiáng)子越俎代庖（e）。IGF2基因座位跨TAD的倍增，導(dǎo)致原本不能調(diào)控IGF2的、來自隔壁TAD的增強(qiáng)子，推動(dòng)了IGF2的表達(dá)（f）。其他的機(jī)制，就請(qǐng)讀者自行讀圖。而這種現(xiàn)象，科學(xué)家將其命名為enhancer hijacking（增強(qiáng)子綁架）。